The Abbott Real-Time HIV-1 assay was evaluated for its performance in quantification of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) RNA in dried blood spot (DBS) samples. In total, 169 blood samples with detectable plasma HIV-1 RNA were used to extract RNA from paired DBS and liquid plasma samples, using the automated Abbott m Sample Preparation System (m2000sp). HIV-1 RNA was then quantitated by the m2000rt RealTime analyser. RNA samples suitable for real-time PCR were obtained from all but one (99.4%) of the DBS samples and HIV-1 RNA was detected in 163/168 (97.0%) samples. The correlation between HIV-1 RNA values measured in paired DBS and plasma samples was very high (r = 0.882), with 78.5% and 99.4% of cases differing by <0.5 and 1.0 log, respectively. Retesting of DBS replicates following 6 months of storage at 2-8 degrees C showed no loss of HIV-1 RNA in a subset of 89 samples. The feasibility of DBS testing coupled with automated sample processing, and the use of a latest-generation FDA-approved real-time PCR-based system, represents an encouraging first step for viral load measurement in reference centres in developing countries where access to antiretroviral therapy is expanding.

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Obiettivo.L'integrazione tra i processi analitici per la quantificazione viremica e per la genotipizzazione di HCV rappresenta un aspetto importante nella organizzazione del flusso di lavoro. Di recente è stato introdotto nel Laboratorio Clinico un nuovo dosaggio per la quantificazione di HCV-RNA, Abbott LCx HCV-RNA, dotato di un ampio intervallo di linearità (23-2.300.000 UI/mL) e basato su RT-PCR competitiva e curva di calibrazione esterna. Il dosaggio amplifica una regione di 104 bp situata nella regione 5' UTR di HCV. Al termine della reazione di RT-PCR i prodotti di amplificazione risultano marcati con gli apteni carbazolo e adamantano e non sono quindi direttamente genotipizzabili mediante "Line Probe Assay" (LiPA, Bayer), che richiede un amplificato biotinilato, rivelato, dopo ibridazione su striscia, mediante streptavidina-fosfatasi alcalina. Abbiamo inteso allora verificare la compatibilità degli estratti ottenuti su colonne QIAmp secondo quanto previsto dalla metodica LCx con il test LiPA (Bayer), previa retrotrascrizione e amplificazione della regione 5'UTR, mediante il kit "HCV RNA screening" della Nuclear Laser Medicine. In particolare vi era da verificare l'eventuale interferenza dello standard quantitativo interno (105 bp) aggiunto all'inizio della fase di estrazione e perciò presente nell'estratto, per la possibilità che tale competitore venisse parimenti amplificato attraverso gli inneschi biotinilati e ibridasse poi sulla striscia LiPA. Metodi.Dei 120 ul di eluato di RNA purificato, 50 ul sono stati impiegati per la determinazione della carica virale mediante LCx e 30 ul sono stati congelati e poi utilizzati per la retrotrascrizione e la successiva amplificazione mediante "HCV-RNA screening" della NLM. Gli amplificati sono stati poi utilizzati per l'ibridazione con metodo LiPA. Risultati.La procedura di genotipizzazione con LiPA da estratto LCx è stata verificata finora su 60 campioni, sui quali sono stati ottenuti tutti i quadri di ibridazione più frequenti, corrispondenti ai genotipi 1a,1b,2a/2c,2, 3a,4,4c/4d. In tutti i campioni saggiati il competitore interno non dà luogo ad alcuna banda di ibridazione, e del resto nessuna banda di ibridazione si ottiene sottoponendo il competitore da solo (in assenza di HCV) a RT-PCR con inneschi NLM e poi a test LiPA. Conclusioni.Gli estratti ottenuti in corso di determinazione quantitativa di HCV-RNA con metodo Abbott LCx possono, previa retrotrascrizione e amplificazione con un kit commerciale per HCV-RNA (NLM), essere utilizzati per la genotipizzazione con la ormai diffusissima metodica LiPA (Bayer). Ciò consente di ottimizzare risorse e tempi di esecuzione per chi utilizzi la metodica LCx per la quantificazione e la metodica LiPA per la genotipizzazione di HCV.

Introduzione. L'adozione nei kit diagnostici del formato "real-time" rappresenta un indubbio progresso nel monitoraggio della risposta alla terapia antivirale dei pazienti con infezione da HCV. L'utilizzo di probe fluorescenti in grado di emettere il segnale associato alla formazione dei prodotti di amplificazione, consente infatti di disporre di risultati quantitativi e allo stesso tempo di raggiungere sensibilità uguale o superiore ai tradizionali test qualitativi. La real time PCR inoltre può quantificare con accuratezza livelli di HCV RNA lungo un intervallo di valori che può estendersi per 6 o 7 ordini di grandezza. Un singolo test può quindi far fronte alla duplice richiesta di test qualitativi e quantitativi, offrendo maggiori velocità ed efficienza diagnostica. Fino a tempi relativamente recenti, i test in real time PCR sono stati disponibili solo sotto forma di dosaggi "in-house". Abbiamo valutato le prestazioni del test Abbott RealTime HCV (range di linearità: 12-10 8 UI/mL), un dosaggio che prevede purificazione dell'RNA, preparazione e dispensazione della mastermix e amplificazione/rilevazione completamente automatici. Metodi. Analisi su campioni non selezionati, afferenti al Laboratorio con richiesta di HCV-RNA qualitativo, testati con Roche Cobas Amplicor (18 campioni), o quantitativo, testati con Versant HCV-RNA 3.0 (75 campioni). Risultati. Per 17 dei 18 campioni con richiesta qualitativa, il risultato del test Abbott RealTime e Amplicor era concordante (1 campione era negativo con Amplicor e "<12 UI/mL, target rilevato" con Abbott). Dei 75 campioni con richiesta quantitativa, 15 erano negativi e 57 positivi per entrambi i test; 3 campioni erano negativi con b-DNA e quantificabili con Abbott RealTime (14, 302, 368 UI/mL). L'analisi di regressione lineare condotta sui 57 campioni con valore compreso nel range dinamico di entrambi i test, mostrava un coefficiente di correlazione r pari a 0,814. Il 75,4% e il 93,0% dei campioni ha mostrato una differenza nei valori di UI/mL inferiore a 0,5 e 1,0 log, rispettivamente. La differenza media Abbott-bDNA è stata di 0,19 log UI/mL. Conclusioni. Il dosaggio Abbott Real-Time HCV ha dimostrato buona concordanza con il test qualitativo e buona correlazione con il test b-DNA. Questa metodica ha mostrato caratteristiche tali da poter essere utilmente impiegata come unico saggio per la determinazione di HCV RNA nella valutazione della risposta virologica in corso di trattamento, al termine della terapia antivirale, e, infine, per le successive verifiche dell'eradicazione virale.

Introduzione. La determinazione della carica virale di HIV-1 su sangue intero essiccato su cartoncino ("Dried Blood Spot"o DBS) presenta dei vantaggi di ordine pratico rispetto al plasma liquido (PL) ed è particolarmente indicata nei paesi in via di sviluppo. Lo scopo del nostro studio è stato quello di verificare l'utilizzo di DBS con il dosaggio Abbott RealTime HIV-1, un test che impiega un particolare formato di tecnologia real-time ("partially double stranded probe"), sviluppato appositamente per tollerare la diversità genetica di HIV-1. Metodi. Sono stati analizzati, per ciascuno dei 169 soggetti con infezione da HIV-1 inclusi nello studio, un campione di PL e uno di DBS. I campioni di PL sono stati testati con il dosaggio Abbott RealTime HIV-1 (protocollo con volume iniziale da 1.0 mL), utilizzando il sistema strumentale Abbott m2000, che prevede estrazione degli acidi nucleici, preparazione e dispensazione della mastermix in totale automazione (m2000sp), seguiti da amplificazione e rivelazione in real-time (m2000rt). I campioni di DBS (Whatman 903) sono stati conservati, prima del dosaggio, a temperatura ambiente per un tempo mediano di 26 giorni (range: 1-170). Per ogni paziente sono stati impiegati due spot da 50 microlitri, ottenuti con un punzonatore ed eluiti con tampone di lisi (kit di estrazione m2000sp). Il surnatante è stato poi analizzato con il sistema m2000sp/m2000rt (protocollo da 1,0 mL). Risultati. I campioni di DBS sono risultati positivi nel 90%, 94,7% e 100% dei campioni con viremia plasmatica compresa tra 2,3 e 3,0; 3,0 e 4,0; 4,0 e 6,1 log copie/mL, rispettivamente. L'analisi di regressione lineare ha mostrato un coefficiente di correlazione r di 0,871. La differenza (media±DS) tra DBS e PL è stata di 0.01±0.39 log copie/mL. Il 78,52% (128/163) e il 99,4% (162/163) dei campioni hanno presentato differenza inferiore a 0,5 e 1,0 log, rispettivamente. La differenza DBS-PL non è correlata con il tempo di conservazione dei DBS (R 2 = 0,0008 e 0,0451 per i due gruppi di campioni provenienti dai due siti), a dimostrazione della stabilità dell'RNA di HIV-1 sui cartoncini Whatman 903. Conclusioni. I campioni di DBS possono essere usati come mezzo di raccolta e conservazione del sangue nel monitoraggio dell'infezione da HIV e della risposta alla terapia antiretrovirale. La totale automazione, la capacità di rilevare e quantificare correttamente tutti i sottotipi virali e le eccellenti prestazioni mostrate in questo studio sui DBS , rendono il dosaggio Abbott RealTime HIV adeguato per la routine nei paesi in via di sviluppo con una elevata prevalenza di infezione da HIV-1. Introduzione. La trasmissione dell'infezione da norovirus (NoV) avviene attraverso il circuito fecale-orale, spesso veicolata da alimenti e acqua contaminati. Un episodio epidemico di gastroenterite acuta si è verificato presso una casa di riposo per anziani nella provincia di Parma, nei giorni immediatamente successivi ad un pranzo pre-natalizio organizzato nella stessa casa il 20 dicembre 2006. 109Metodi. Tutti i soggetti che...