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Obiettivo.L'integrazione tra i processi analitici per la quantificazione viremica e per la genotipizzazione di HCV rappresenta un aspetto importante nella organizzazione del flusso di lavoro. Di recente è stato introdotto nel Laboratorio Clinico un nuovo dosaggio per la quantificazione di HCV-RNA, Abbott LCx HCV-RNA, dotato di un ampio intervallo di linearità (23-2.300.000 UI/mL) e basato su RT-PCR competitiva e curva di calibrazione esterna. Il dosaggio amplifica una regione di 104 bp situata nella regione 5' UTR di HCV. Al termine della reazione di RT-PCR i prodotti di amplificazione risultano marcati con gli apteni carbazolo e adamantano e non sono quindi direttamente genotipizzabili mediante "Line Probe Assay" (LiPA, Bayer), che richiede un amplificato biotinilato, rivelato, dopo ibridazione su striscia, mediante streptavidina-fosfatasi alcalina. Abbiamo inteso allora verificare la compatibilità degli estratti ottenuti su colonne QIAmp secondo quanto previsto dalla metodica LCx con il test LiPA (Bayer), previa retrotrascrizione e amplificazione della regione 5'UTR, mediante il kit "HCV RNA screening" della Nuclear Laser Medicine. In particolare vi era da verificare l'eventuale interferenza dello standard quantitativo interno (105 bp) aggiunto all'inizio della fase di estrazione e perciò presente nell'estratto, per la possibilità che tale competitore venisse parimenti amplificato attraverso gli inneschi biotinilati e ibridasse poi sulla striscia LiPA. Metodi.Dei 120 ul di eluato di RNA purificato, 50 ul sono stati impiegati per la determinazione della carica virale mediante LCx e 30 ul sono stati congelati e poi utilizzati per la retrotrascrizione e la successiva amplificazione mediante "HCV-RNA screening" della NLM. Gli amplificati sono stati poi utilizzati per l'ibridazione con metodo LiPA. Risultati.La procedura di genotipizzazione con LiPA da estratto LCx è stata verificata finora su 60 campioni, sui quali sono stati ottenuti tutti i quadri di ibridazione più frequenti, corrispondenti ai genotipi 1a,1b,2a/2c,2, 3a,4,4c/4d. In tutti i campioni saggiati il competitore interno non dà luogo ad alcuna banda di ibridazione, e del resto nessuna banda di ibridazione si ottiene sottoponendo il competitore da solo (in assenza di HCV) a RT-PCR con inneschi NLM e poi a test LiPA. Conclusioni.Gli estratti ottenuti in corso di determinazione quantitativa di HCV-RNA con metodo Abbott LCx possono, previa retrotrascrizione e amplificazione con un kit commerciale per HCV-RNA (NLM), essere utilizzati per la genotipizzazione con la ormai diffusissima metodica LiPA (Bayer). Ciò consente di ottimizzare risorse e tempi di esecuzione per chi utilizzi la metodica LCx per la quantificazione e la metodica LiPA per la genotipizzazione di HCV.

M e d i c a 228 lizzata la capacità del GBV-C di stimolare in vitro la produzione di IFN su PBMC di donatori sani. Risultati. I risultati indicano un significativo aumento dei valori di espressione dell'IFN-gamma nei pazienti GBV-C positivi. Tale aumento correlava con l'espressione di tutti gli altri geni tranne che con l'MxA e l'IFN-alfa, suggerendo una attivazione coordinata di questi geni guidata dall'IFNgamma. Nei pazienti di cui era disponibile un prelievo a tempi successivi, si è riscontrato che la perdita/acquisizione del GBV-C era associata ad una diminuzione/aumento dei livelli di espressione di questi geni. Nei PBMC di donatori sani messi in contatto con plasma contenente GBV-C si è riscontrata una stimolazione della produzione di IFN-gamma. Conclusioni. I nostri studi, sia ex vivo che in vitro, dimostrano un aumento dell'espressione dell'IFN-gamma collegata alla presenza del GBV-C. Tale fenomeno potrebbe essere coinvolto nell'azione protettiva del GBV-C sulla progressione dell'infezione di HIV.

Introduzione. Abbiamo valutato le prestazioni del nuovo dosaggio Abbott Real-Time HIV-1 RNA quantitativo basato su estrazione automatica e chimica non esonucleasica (strand-displacement probe). Questo formato dovrebbe garantire robustezza nei confronti di eventuali "mismatches" presenti nella regione di ibridizzazione del probe. Il range dinamico del test (protocollo con volume iniziale di 1 mL) è compreso tra 40 e 10 7 copie/mL. Lo studio è stato eseguito con volume inizale di 0,5 mL (sensibilità 75 copie/mL). Metodi. Sono stati analizzati 79 campioni retrospettivi da 60 pazienti con infezione da HIV, il cui monitoraggio della carica virale era stato effettuato con il test b-DNA v.3 (Bayer). Risultati. Considerando il limite di sensibilità di 75 e 50 copie per Abbott e b-DNA rispettivamente, la concordanza qualitativa dei dosaggi era pari al 93,7% (74/79) con 3 risultati Abbott positivi/b-DNA negativi (range 80-154 copie/mL) e 2 bDNA postitivi/Abbott negativi (277 e 811 copie/mL). Vi erano inoltre 3 campioni con risultato Abbott <75 copie/mL ma con target rilevato, che erano <50 copie/mL con b-DNA. Per i 59 campioni quantificabili con entrambi i metodi, la retta di regressione lineare tra i valori Abbott (y) e b-DNA (x) aveva equazione y = 0,921x +0,573 (r= 0,882). Il 71% e il 93% dei campioni mostrava una differenza compresa entro 0,5 ed 1,0 log rispettivamente, con una differenza media Abbott-bDNA di 0,27 log (DS=0,48log). Analizzando separatemente i campioni in base alla provenienza geografica, differenza media e coefficiente di correlazione r erano 0,12 log/0,834 per i soggetti di nazionalità italiana e di 0,41 log/0,967 per quelli non italiani (in prevalenza africani). Conclusioni. Il dosaggio Abbott Real-Time ha mostrato una buona correlazione ed una sostanziale equivalenza con il test b-DNA v.3. La differenza media dei valori osservati sembra essere influenzata dalla provenienza geografica dei campioni.

Introduzione. La quasi totalità dei pazienti trapiantati di cuore sviluppa un'infezione da CMV che nel 9-35% dei casi, in assenza di strategie di profilassi o di terapia presintomatica, ha ripercussione clinica di varia entità. Questo studio ha valutato il valore diagnostico e prognostico della quantificazione di CMV in campioni di sangue di pazienti trapiantati di cuore nel monitoraggio della fase post trapianto e studiato l'andamento della risposta immunitaria cellulo T-mediata CMV-specifica durante la sorveglianza virologica. Metodi. Sono stati monitorati 30 pazienti trapiantati di cuore di cui 3 R-/D+. Tutti i pazienti sono stati sottoposti a profilassi con valganciclovir per 40 giorni post-trapianto. Il monitoraggio della fase viremica di CMV è stato condotto con il test dell'antigenemia e con la PCR-Real Time. Il monitoraggio immunologico è stato eseguito in 12 pazienti. Le sospensioni di linfociti T ottenuti dai pazienti sono stati processati con la tecnica ELISPOT. 402 sono il numero di campioni di sangue processati con i test virologici molecolari e non e 40 quelli sottoposti ad ELISPOT. Risultati. Nonostante l'intervento di profilassi la prevalenza dell'infezione da CMV documentata dagli esami virologici è risultata pari al 70% (21/30) e dei 21 pazienti infetti, 4 hanno presentato una lieve-moderata infezione sintomatica (leucopenia e febbre). I tempi di insorgenza dell'infezione attiva da CMV sono stati in media pari a circa 75 giorni dal momento del trapianto. Dei 17 pazienti asintomatici l'intervento con terapia pre-sintomatica è stato eseguito in 6 casi (35%). I pazienti (9/12), con una precoce ricostituzione o sviluppo (entro i 30 giorni posttrapianto) della risposta immune linfocita T CMV-specifica hanno presentato una minor durata dell'infezione e picchi di carico virale ematico inferiore rispetto ai pazienti con una tardiva risposta CMV specifica. Conclusioni. Nei trapiantati di cuore il monitoraggio immunologico, combinato con quello virologico, può ulteriormente essere di ausilio nel riconoscere i pazienti a rischio di insorgenza di infezioni recidive da CMV che, come riportato recentemente in letteratura, favoriscono gli eventi di vasculopatia coronaria del graft trapiantato e di rigetto cardiaco acuto/cronico. Introduzione. I dosaggi per la quantificazione di HBV-DNA si sono dimostrati utili nella valutazione pre-trattamento, nella stadiazione clinica e nel monitoraggio della terapia antivirale per l'epatite cronica B. La capacità di rilevare minime concentrazioni è utile al clinico per valutare la risposta terapeutica e attuare gli idonei interventi. Una ricaduta successiva alla cessazione della terapia antivirale, l'emergenza di mutazioni nel genoma virale associate a resistenza, o la mancanza di aderenza alla terapia, sono tutte condizioni che possono essere rilevate immediatamente se si impiegano dosaggi ad elevata sensibilità. I progressi compiuti dalle tecnologie molecolari, ed in particolare l'introduzione della real-time PCR, sembrano finalmente realizzare la promessa iniziale di un...