The binding of several aminoglycoside antibiotics to human serum proteins was studied under varying experimental conditions. The protein binding was determined by means of equilibrium dialysis and, with sisomicin and gentamicin, also by the ultracentrifuge method in the presence and in the absence of Ca++ and Mg++ ions. The technical experimental procedure (dialysis, ultrafiltration, ultracentrifugation) has no effect on protein binding contrary to the physico-chemical conditions (varying concentrations of Ca++ and Mg++ ions). Under experimental conditions closely conforming to physiological conditions, the aminoglycosides of the kanamycin and neomycin series are not bound by the serum proteins, independent of the assay method used, whereas streptomycin is bound under these conditions. In the absence of divalent cations all the aminoglycosides studied were bound by the serum proteins to varying degrees; the fewer the OH groups contained in the aminoglycoside molecule the greater the rate of protein binding. At equal protein concentration, the albumin fraction of the serum has as great a binding capacity for sisomicin as gamma globulin. Alpha-1 and beta-1 globulin, however, are unable to bind sisomicin.

Zusammenfassung: Der bisher aus dem Circulardichroismus von Proteinen berechnete Gehalt an -Helix, ß-Struktur und ungeordneter Konformation stimmt nur zum Teil mit den aus Röntgenstruktur-Untersuchungen erhaltenen Befunden überein. Diese Abweichung beruht vor allem darauf, daß die CD-Spektren der verwendeten Modellsubstanzen zur Berechnung ungeeignet sind. Eine bessere Übereinstimmung zwischen den nach beiden Methoden ermittelten Werten erhält man, wenn man der Berechnung außer den CD-Spektren von Poly-L-Lysin das CD-Spektrum von Poly-L-Serin bei hohem Salzgehalt zugrunde!» gt. Dieses CD-Spektrum ist nämlich nach neueren Auffassungen für die ungeordnete Konformation charakteristisch und nicht die CD-Spektren von Polyaminosäuren in salzfreier Lösung, wie bisher angenommen wurde. Auf diese Weise erhält man für helicale Proteine von bekannter Konformation, wie Myoglobin, Lysozym oder Ribonuclease, sowohl den richtigen Gehalt an -Helix, ß-Struktur und ungeordneter Konformation als auch eine gute Übereinstimmung zwischen den experimentell beobachteten mit den berechneten CD-Spektren der Proteine.Summary: An improved method for the evaluation of helical protein conformation by means of circular dichroism. The amounts of -helical, ß-structural and unordered conformation of proteins calculated to date from circular dichroism and those derived from X-ray diffraction only show partial agreement. The deviations are mainly due to the fact that the CD-spectra of the usual synthetic polypeptide models are not suitable for the calculation. A better agreement between the amounts of the conformation derived from both methods is achieved by basing the calculation on the CDspectra not only on poly L-lysine but also on poly L-serine with high salt-content. According to recent ideas, the latter spectrum corresponds to the unordered conformation, while that of poly amino acids in the absence of salts is no longer thought to represent the unordered state. On this principle the percentage of -helix, ß-structure and unordered conformation of helical proteins of known conformation, such as myoglobin, lysozyme or ribonuclease, can be calculated very well. It is now possible to fit the experimental circular dichroism pattern with the calculated curves over the entire spectral range.

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The aminoglycosides of the kanamycin and neomycin series are displaced from their protein binding by very low Ca++ ion concentrations, whereas streptomycin is displaced only by very high Ca++ ion concentrations. For streptomycin, therefore, the binding mechanism must differ from that for the other aminoglycosides. The displacing reaction cannot be described by the law of mass action, combining the binding equations. Several possible reasons, such as complex formation and changes in the conformation of albumin, are discussed. Complex formation between sisomicin and the lanthanide ion Nd+++, which has the same ionic radius as the Ca++ ion, could be excluded by recording the difference absorption spectrum. The displacement of the aminoglycosides from their protein binding by Ca++ ions (as well as the pH dependence of the protein binding) suggests that ionic bonds are involved in the interactions between aminoglycosides and serum proteins.

ZUSAMMENFASSUNG: Die Wellenlangenabhangigkeit des optischen Drehungsvermogens des Kallikrein-Inaktivators (KI) (identisch mit dem KumTz-Inhibitor = ,,pancreatic trypsin inhibitor") laBt sich im Sichtbaren und nahen UV durch die Gleichungen von DRUDE, MOFFITT und YANG bzw. von SHECHTER und BLOUT darstellen. Die Dispersionskonstante Ac = 234 mp und .die Konstante b, = 169 bleiben bei pH-hderungen der Losung zwischen 2 und 12 und ebenso in konzentrierten Harnstofflosungen und Chlorathanollosungen unverandert. Die SekundLstruktur des KI ist daher unter diesen Versuchsbedingungen bestandig. 'Die Rotationskonstante K und die Konstante a, sind bei KI-Praparaten, die mit Komplexbildnern Assoziate zu bilden vermogen, von der Konzentration und vom pH-Wert der Losung abhangig. Zwischen uer GroBe des spezifischen Drehun;svermogens, der Rotationskonstante K bzw. der Konstante a, , und dem Molekulargewicht dieser Praparate besteht eine Relation. Die h d e r u n g dieser Konstanten wird von der Anderung der Tertiar-bzw. Quartiirstruktur des K I bedingt. Bei der Denaturierung des K I in alkalischen Losungen (PH 12,s und 13) nimmt das Molekulargawicht des K I zu und das spezifische Drehungsvermogen Die Kurve der Rotationsdispersion zeigt bei 225 mp ein Minimum und bei 195 mp ein Maximum des spezifischen Drehungsvermogens. Der ausgepragte COTTON-Effekt ist ein Hinweis dafiir, da13 Teile des KI-Molekiils in geordneter Form vorliegen. Die Rotationsdispersionskurve des K I und der Circulardichroismus sind uncharakteristisch fur die bekannten Strukturformen (z. B. a-Helix). Das UV-Spektrum des KI und der Circulardichroismus werden fur verschiedene PHWerte ermittelt. Beide Grol3en werden vor allem vom Tyrosingehalt des K I bestimmt. l m UV-Spektrum des reinen K I existieren zwei isosbestische Punkte, und zwar bei 271 und 283 mp. Die Dissoziation der vier Tyrosingruppen erfolgt in zwei Phasen. Zwei Tyrosingruppen zeigen normales Dissoziationsverhalten (apparenter pK-Wert 10,O). Die Dissoziation der 3. und 4. Tyroeingruppe erfolgt erst in alkalischer Losung (apparenter pK-Wert = 12,O) und ist irreversibel. ab. SUMMARY:The optical rotatory dispersion of the kallikrein inactivator (KI) (identical with the KuNITz-inhibitor = ,,pancreatic trypsin inhibitor") can be described in the visible ranges closed to the ultraviolet by the equations of DRUDE, MOFFITT and YANG, and Of SHECHTER and BLOUT. The dispersion constant h, = 234 mp and the constant b, = 169 are independent