Healthcare Associated Infections/HAIs merupakan persoalan serius di fasilitas kesehatan yang bisa menjadi penyebab kematian pasien dan bertambahnya hari rawat. Universal precaution dirancang di rumah sakit sebagai langkah awal untuk tindakan pencegahan HAIs. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi Praktik Perawat dalam pelaksanaan unversal precaution pencegahan infeksi di RSUD Brebes.Jenis penelitian observasional kuantitatif dengan pendekatan cross sectional. Jumlah sampel 130 perawat, teknik pengambilan sampel dalam penelitian ini menggunakan non probability sampling dengan prosedur convenient/judgement sampling. Pengumpulan data menggunakan kuesioner dan lembar observasi. Analisis data dengan program SPSS menggunakan korelasi rank spearman dan regresi logistik metode enter.Hasil penelitian menunjukkan pengetahuan perawat sebagian besar baik 70,8%, sikap perawat sebagian besar baik 58,5%, praktik perawat sebagian besar baik 50,8%. Uji hubungan rank spearman menunjukkan adanya hubungan antara pengetahuan dan sikap dengan praktik perawat dalam pelaksanaan universal precaution dengan nilai p-value < 0,05. Analisis multivariat regresi logistik menunjukkan pengetahuan dengan nilai rho 5,351 dan sikap dengan nilai rho 6,835 secara bersama-sama berpengaruh terhadap Praktik Perawat dalam pelaksanaan universal precaution. Saran untuk meningkatkan praktik perawat dalam pelaksanaan universal precaution perlu dilakukan  usaha untuk meningkatkan pengetahuan dan sikap perawat dengan cara mengadakan pelatihan .