For the purpose of a industrial process of cellulosic ethanol production, an efficient β-glucosidase was evolved by L-Shuffling starting from three parental genes (i.e., Chaetomium globosum glucosidase putative gene, Trichoderma reesei bgl1 gene, and Neurospora crassa glucosidase putative gene, named genes A, B, and C, respectively) originating from microbial biodiversity and showing 70% of identity at the amino acid level. Enzyme B (encoded by bgl1 gene) was chosen as a reference so that the backbone of the evolved enzymes would be based on this enzyme. Two rounds of L-Shuffling and colonies screening (20,000 colonies per round) on chromogenic glucose substrate were performed. Compared with native β-glucosidase, the most evolved enzyme has a 242-fold increased k cat for the pNPGlc substrate. After expression of this improved β-glucosidase in T. reesei, a new efficient enzymatic cocktail was secreted by the strain allowing for a 4-fold decrease in cellulase loading without any loss in hydrolysis performance of degradation of a steam-exploded wheat straw compared to the untransformed parental strain.

No abstract

No abstract

Re´sume´-Comment les technologies d'e´volution mole´culaire peuvent fournir des enzymes industrielles sur mesure : application aux biocarburants -L'hydrolyse enzymatique de la lignocellulose est l'un des principaux goulets d'e´tranglement dans le de´veloppement de la conversion biologique de la biomasse lignocellulosique en biocarburants. L'un des organismes les plus efficaces pour la production d'enzymes cellulolytiques est le champignon Trichoderma reesei, principalement graˆce a`sa capacite´importante de se´cre´tion. La conversion de la cellulose en glucose implique trois types de cellulases travaillant en synergie : les endoglucanases (EC 3.2.1.4) clivant de fac¸on ale´atoire les liaisons glycosidiques en b-1,4, les cellobiohydrolases (EC 3.2.1.91) attaquant la chaıˆne de cellulose aux deux extre´mite´s afin de produire le cellobiose, dime`re qui sera converti en glucose par l'action des b-glucosidases (EC 3.2.1.21). De fac¸on inattendue, la quantite´de b-glucosidase (BGL1) se´cre´te´e par les souches de T. reesei repre´sente un tre`s faible pourcentage de la quantite´totale des prote´ines se´cre´te´es qui en fait donc une activite´limitante du cocktail. Cette faible activite´limite d'autant plus les performances du cocktail que le cellobiose repre´sente le principal inhibiteur de la re´action cellulolyse par les cellobiohydrolases. Ce goulot d'e´tranglement peut eˆtre atte´nue´soit par une surexpression de la b-glucosidase chez T. reesei, soit par une ame´lioration de son activiteś pe´cifique. Apre`s un bref aperc¸u des principales technologies existantes, cet exemple sera utilise´dans cette revue pour illustrer le potentiel des technologies d'e´volution dirige´e pour de´velopper des enzymes re´pondant aux besoins de l'industrie des biotechnologies. Nous de´crivons comment la mise en oeuvre d'une strate´gie d'e´volution dirige´e par le L-Shuffling TM avec trois ge`nes parentaux provenant de la biodiversite´microbienne permet d'obtenir des activite´s b-glucosidases tre`s ame´liore´es par rapport a`la Cel3a b-glucosidase de T. reesei (activite´spe´cifique 242 fois plus e´leve´e pour le substrat pNPGlc). Cette ame´lioration de l'activite´glucosidasique, apre`s expression du ge`ne codant pour la b-glucosidase ame´liore´e chez T. reesei et se´cre´tion du nouveau cocktail, permet une diminution d'un facteur 4 de la quantite´de cocktail ne´cessaire a`la saccharification d'une biomasse industrielle pre´traite´e (paille de ble´).Abstract -How Molecular Evolution Technologies can Provide Bespoke Industrial Enzymes: Application to Biofuels -Enzymatic hydrolysis of lignocellulose is one of the major bottlenecks in the development of biological conversion of lignocellulosic biomass to biofuels. One of the most efficient organisms for the production of cellulolytic enzymes is the fungus Trichoderma reesei, Oil & Gas Science and Technology -Rev. IFP Energies nouvelles, Vol. 68 (2013), No. 4, pp. 681-691 Copyright Ó 2013, IFP Energies nouvelles DOI: 10.2516 mainly thanks to its high secretion capacity. The conversion of ...