This work shows that although Raiden has fewer cross-reactive components than conventional soybean, it still has a residual cross-reactive component: the alpha-subunit beta-conglycinin. This reactivity might make this genotype unsuitable to treat CMA and also explains adverse reactions to soybean in CMA infants.

SummaryPlant‐based platforms are extensively used for the expression of recombinant proteins, including monoclonal antibodies. However, to harness the approach effectively and leverage it to its full potential, a better understanding of intracellular processes that affect protein properties is required. In this work, we examined vacuolar (vac) targeting and deposition of the monoclonal antibody (Ab) 14D9 in Nicotiana benthamiana leaves. Two distinct vacuolar targeting signals (KISIA and NIFRGF) were C‐terminal fused to the heavy chain of 14D9 (vac‐Abs) and compared with secreted and ER‐retained variants (sec‐Ab, ER‐Ab, respectively). Accumulation of ER‐ and vac‐Abs was 10‐ to 15‐fold higher than sec‐Ab. N‐glycan profiling revealed the predominant presence of plant typical complex fucosylated and xylosylated GnGnXF structures on sec‐Ab while vac‐Abs carried mainly oligomannosidic (Man 7‐9) next to GnGnXF forms. Paucimannosidic glycans (commonly assigned as typical vacuolar) were not detected. Confocal microscopy analysis using RFP fusions showed that sec‐Ab‐RFP localized in the apoplast while vac‐Abs‐RFP were exclusively detected in the central vacuole. The data suggest that vac‐Abs reached the vacuole by two different pathways: direct transport from the ER bypassing the Golgi (Ab molecules containing Man structures) and trafficking through the Golgi (for Ab molecules containing complex N‐glycans). Importantly, vac‐Abs were correctly assembled and functionally active. Collectively, we show that the central vacuole is an appropriate compartment for the efficient production of Abs with appropriate post‐translational modifications, but also point to a reconsideration of current concepts in plant glycan processing.

La utilización de plantas como biorreactores, en la producción de proteínas de interés, como vimos en secciones anteriores, presenta como principales inconvenientes que los niveles de acumulación logrados hasta ahora son muy bajos (menos de 1% de la proteína soluble total (Stoger et al., 2005; Ma et al., 2005; Petruccelli et al., 2006) y, que el conocimiento de las modificaciones postraduccionales es escaso. Se ha propuesto que la hidrólisis de la proteína heteróloga podría ser uno de los factores que determina esos bajos niveles de acumulación. Las células vegetales poseen además de las vacuolas líticas, organelas con capacidad de almacenar proteínas y que han sido descriptos en distintos tejidos y células en diversas condiciones fisiológicas (Paris et al., 1996; Di Sansebastiano et al., 1998; Hayashi et al., 1999). En este trabajo se plantea el tratar de aportar una solución al problema de la hidrólisis de la proteína de interés a través su direccionamiento a organelas donde podría almacenarse de manera estable. Por ello, se estudiará por un lado el empleo de la secuencia KDEL, que en hojas determina que la proteína de interés se acumule en el retículo endoplásmico, pero que en órganos de reserva podría dirigir a vacuolas de reserva de proteínas (PSV). Por otro lado, teniendo en cuenta que el mecanismo que determina el direccionamiento de proteínas de reserva a PSV aún se encuentra en etapas de esclarecimiento se estudiará si secuencias derivadas de una globulina 11S de amaranto (Amaranthus hipocondriacus) pueden emplearse con esta finalidad.