Resistensi dan toksisitas antimikroba menyebabkan penggunaan obat herbal sebagai alternatif pengobatan berbagai penyakit yang disebabkan oleh mikroba. Ekstrak etanol daun ceremai memiliki aktivitas terhadap VRE, MRCNS, dan Candida albicans. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antimikroba fraksi etil asetat daun ceremai terhadap bakteri resisten antimikroba [Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Methicillin-Resistant Coagulase Negative Staphylococcus (MRCNS), Vancomycin Resistant Enterococcus (VRE)] dan jamur uji (Candida albicans, Microsporum gypseum, dan Aspergillus niger) dengan metode KLT bioautografi. Fraksinasi dilakukan dengan cara ekstraksi cair-cair menggunakan pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda, yaitu n-heksan, etil asetat, dan air. KLT bioautografi pada fraksi etil asetat daun ceremai dilakukan menggunakan fase diam silika gel GF254 dan pengembang etil asetat-asam format-asam asetat-air (100:10:10:22), menggunakan sitroborat sebagai penampak bercak. Pada hasil kromatogram terdapat 5 noda yang berfluoresensi hijau kekuningan dengan nilai rf noda 1 sebesar 0,35; noda 2 sebesar 0,43, noda 3 sebesar 0,62, noda 4 sebesar 0,75 dan noda 5 sebesar 0,90 setelah plat disemprot oleh sitroborat dan dilihat di bawah sinar UV. Hasil pengujian aktivitas antimikroba dengan metode KLT bioautografi menunjukkan terbentuknya zona bening yang dihasilkan noda pada plat yang ditempelkan pada media. Fraksi etil asetat daun ceremai memiliki aktivitas antimikroba terhadap bakteri resisten antimikroba (MRSA, MRCNS, dan VRE) dan jamur uji (Candida albicans, Microsporum gypseum, dan Aspergillus niger) yang dihasilkan oleh noda 1 (rf 0,35), noda 2 (rf 0,43), noda 3 (rf 0,62), noda 4 (rf 0,75), dan noda 5 (rf 0,90). Golongan senyawa yang diduga memiliki aktivitas antimikroba adalah flavonoid.