Latar belakang. Cuci tangan merupakan strategi efektif menurunkan kejadian infeksi aliran darah (IAD). Namun, angka kepatuhan cuci tangan tenaga kesehatan masih belum optimal, khususnya di Unit Neonatal. Program edukasi terhadap tenaga kesehatan dilakukan untuk meningkatkan kepatuhan cuci tangan. Tujuan. Mengetahui hubungan kepatuhan cuci tangan tenaga kesehatan terhadap kejadian IAD di Unit Neonatal sebelum dan setelah edukasi. Metode. Studi dengan desain potong lintang dilakukan di Unit Neonatal RSUPN Dr. Cipto Mangunkusumo (RSCM) periode Juli 2012-September 2014 sebelum dan setelah edukasi. Hasil. Rerata kepatuhan cuci tangan 68%, dengan kepatuhan tertinggi adalah perawat (69% sebelum edukasi dan 72,5% setelah edukasi), sedangkan terendah adalah petugas laboratorium (22%). Tingkat kepatuhan cuci tangan di unit level 2 lebih tinggi (73%) daripada level 3 (68,5%). Kepatuhan cuci tangan tenaga kesehatan terhadap kejadian IAD baik sebelum dan setelah edukasi tidak bermakna secara statistik (nilai p>0,05). Kesimpulan. Tidak terdapat hubungan antara kepatuhan cuci tangan tenaga kesehatan terhadap kejadian IAD di Unit Neonatal sebelum dan setelah edukasi. Sari Pediatri 2017;18(6):443-7Kata kunci: kepatuhan cuci tangan, infeksi aliran darah, unit rawat neonatal