Aim. To study the chemical composition, sugar specificity and physicochemical properties of the extracellular lectin isolated from Bacillus subtilis ІМV В-7724. Methods. Biochemical, spectrophotometric, immunological and cultural methods were used to assess the physicochemical and a number of biological properties of lectin isolated from the culture fluid of bacteria B. subtilis ІМV В-7724. Molecular weight of the lectin was estimated in polyacrylamide gel electrophoresis. Analysis of the elemental composition was done using Perkin-Elmer 2400 CHNS analyzer. Temperature and pH stability of lectin were examined based on residual hemagglutination activity of the lectin. Cytotoxic activity was determined by the MTT-assay. The statistical analysis was made using Student’s t-test. Results. B. subtilis IMV B-7724 lectin is a glycoprotein (protein – 86.0%, carbohydrates – 7.0%) with molecular weight of 18–20 kDa (major). Analysis of the elemental composition revealed that it contains 34.00% of carbon, 7.04% of hydrogen, 16.61% of nitrogen, 42.35% of oxygen. Amino acid composition analysis determined that it is rich in leucine, tyrosine and phenylalanine. The lectin exhibited high sugar-binding specificity toward N-acetylneuraminic and N-glycolylneuraminic acids (minimal inhibitory concentration – 0.3 mM for both sugars). The lectin is heat and acid stable, has long shelf life. Conclusions. These results provide the rationale to pursue further investigation for possible ways and modes of B. subtilis IMB B-7724 lectin application in clinical settings.

No abstract

ВСТУП. Подолання імунологічної толе рант-ності до пухлиноасоційованих антигенів (ПАА) є ключовим завданням імунотерапії пухлинної хвороби [1,2]. Одним із підходів до його вико-нання є розробка та застосування ксеногенних протипухлинних вакцин (ПВ), які містять пухлинні антигени організмів іншого виду [3]. Показано, що саме використання чужорідних аналогів ПАА здатне викликати імунну відповідь проти власних ендогенних протеїнів [4, 5]. Більш того, структурні відмінності ксеногенних ПАА від їх людських аналогів сприяють індукції специфічних про-типухлинних реакцій не тільки на ранніх, але й на пізніх стадіях захворювання, коли організм хво рого перебуває під імуносупресивним впли вом пухлини та власної імунної системи. То му, порівняно з гомологічними аналогами, ксеногенні ПВ можуть стати ефективнішими як для профілактики розвитку рецидивів та метастазів, так і для генерації процесів, що призводять до руйнування розвинутої пухлини [2,6, 7].Експресія ембріональних антигенів супрово-джує процес трансформації нормальної кліти-ни в злоякісну [8,9], тому їх використання як "універсальних" специфічних імуногенів від-криває нові можливості в конструюванні ксе-ногенних ПВ [10,11]. У попередній роботі ми показали, що ПВ, виготовлені на основі антигенів ембріональних тканин різного гістогенезу лю -дини та глікопротеїду в. subtilis B-7025, про-являли протипухлинну активність у мишей із саркомою 37 [12]. Одержано високомолекулярні ембріональні протеїни курки (ЕПК), які мають певну гомологію з поверхневими протеїнами клітин модельних пухлин [13] і в подальшому можуть бути використані як компоненти при конструюванні ксеногенних ПВ [14, 15].Для підвищення імуногенності зазначених ЕПК та посилення специфічної імунної відповіді необхідно підібрати відповідний ефективний ад'ювант. Особливо перспективними на сьо-год ні є ад'юванти мікробного походження, які взаємодіють з Toll-подібними рецепторами клітин природного імунітету та запускають про-цес формування адаптивного імунітету, тому їх досить широко використовують для виготовлення ПВ [16,17]. Крім того, ад'юванти, отримані з бактеріальних продуктів, здатні модифікувати ПАА, індукувати продукування широкого спектра цитокінів, що дозволяє суттєво зменшити дозу імуногена і частоту його введення [18].Метою даної роботи було вивчити можливість підсилення імунної відповіді організму тварин на ксеногенні ембріональні протеїни за допомогою ад'ювантів різного походження.

Summary. Background: The impact of growing tumor on polarization and functions of tumor-associated macrophages is well known while its influence on residential macrophages occupying different anatomical niches reminds to be elucidated. Aim: To study changes in polarization and functions of macrophages isolated from discrete anatomical niches in tumor-bearing mice at different stages of tumor growth. Materials and Methods: Ehrlich carcinoma was transplanted intramuscularly to Balb/c male mice. On days 7, 14, 21 and 28 after tumor transplantation, macrophages from tumor tissue, peritoneal cavity and spleen were isolated and analyzed. Nitric oxide production was measured by standard Griess reaction, arginase activity was determined by the measurement of urea, reactive oxygen species production was checked using NBT dye reduction assay and electron paramagnetic resonance spectroscopy, cytotoxic activity was estimated in MTT-assay. Results: Independently of their localization in different anatomic niches, macrophages in mice with transplanted Ehrlich carcinoma gradually lose their tumoricidal activities while arginase activity is upregulated. This indicates the shift of polarization from M1-like towards M2-like phenotype. Conclusion: Our findings demonstrated that growing tumor could be able to subvert functioning of macrophages at the systemic level.

Мета дослідження – оцінити параметри гострої токсичності лектину B. subtilis IMB B-7724 за умови його одноразового введення мишам двох ліній.Дослідження виконані на мишах ліній Balb/c (n = 96) і C57Bl (n = 96). Шляхи введення лектину: підшкірний (п/ш), внутрішньоочеревинний (в/о), пероральний (per os). Використані дози лектину: 125, 250, 375, 500 мг/кг ваги тварини (п/ш і в/о); 500 мг/кг (per os). Мишам контрольної групи вводили фізіологічний розчин NaCl. За показниками виживаності та смертності визначали максимально переносиму (LD0) та смертельну (LD100) дози; проводили розрахунок середньосмертельної дози (LD50) за методами Кербера та Беренса.LD50 лектину B. subtilis IMB B-7724 у разі його введення per os і п/ш мишам ліній Balb/c і C57Bl перевищувала максимальну досліджувану дозу (500 мг/кг). В/о введення лектину B. subtilis IMB B-7724 супроводжувалось дозозалежним токсичним впливом: LD0 = 125 мг/кг, LD16 = 132 мг/кг, LD100 = 500 мг/кг. Показники LD50, які розраховані за двома різними методами, суттєво не відрізнялись і складали 278,8–281,3 мг/кг (для мишей лінії Balb/c) і 231,1–250,0 мг/кг (для мишей лінії C57Bl). Оцінка параметрів гострої токсичності дозволяє віднести досліджуваний лектин B. subtilis IMB B-7724 до малотоксичних речовин. Отримані результати свідчать про доцільність проведення подальших доклінічних досліджень з метою розробки на основі даного бактеріального лектину нового терапевтичного засобу.