Poly(ADP-ribos)ylation (PARylation) is a major posttranslational modification and signaling event in most eukaryotes. Fundamental processes like DNA repair and transcription are coordinated by this transient polymer and its binding to proteins. ADP-ribosyltransferases (ARTs) build complex ADP-ribose chains from NAD(+) onto various acceptor proteins. Molecular studies of PARylation thus remain challenging. Herein, we present the development of bioorthogonally functionalized NAD(+) analogues for the imaging of PARylation in vitro and in cells. Our results show that 2-modified NAD(+) analogues perform remarkably well and can be applied to the in-cell visualization of PARylation simultaneously in two colors. This tool gives insight into the substrate scope of ARTs and will help to further elucidate the biological role of PARylation by offering fast optical, multichannel read-outs.

Poly(ADP ribos)ylation (PARylation) is an impor tant posttranslational protein modification, and is involved in major cellular processes such as gene regulation and DNA repair. Its dysregulation has been linked to several diseases, including cancer. Despite its importance, methods to observe PARylation dynamics within cells are rare. By following a chemical biology approach, we developed a fluorescent NAD + analogue that proved to be a competitive building block for protein PARylation in vitro and in cells. This allowed us to directly monitor the turnover of PAR in living cells at DNA damage sites after near infrared (NIR) microirradiation. Addi tionally, covalent and noncovalent interactions of selected target proteins with PAR chains were visualized in cells by using FLIM FRET microscopy. Our results open up new opportunities for the study of protein PARylation in real time and in live cells, and will thus contribute to a better under standing of its significance in a cellular context.

ADP-ribosyl transferases with diphtheria toxin homology (ARTDs) catalyse the covalent addition of ADP-ribose onto different acceptors forming mono- or poly(ADP-ribos)ylated proteins. Out of the 18 members identified, only four are known to synthesise the complex poly(ADP-ribose) biopolymer. The investigation of this posttranslational modification is important due to its involvement in cancer and other diseases. Lately, metabolic labelling approaches comprising different reporter-modified NAD+ building blocks have stimulated and enriched proteomic studies and imaging applications of ADP-ribosylation processes. Herein, we compare the substrate scope and applicability of different NAD+ analogues for the investigation of the polymer-synthesising enzymes ARTD1, ARTD2, ARTD5 and ARTD6. By varying the site and size of the NAD+ modification, suitable probes were identified for each enzyme. This report provides guidelines for choosing analogues for studying poly(ADP-ribose)-synthesising enzymes.

Poly(ADP-Ribos)ylierung (PARylierung) ist eine wichtige posttranslationale Proteinmodifikation,d ie in grundlegende zelluläre Prozesse wie Genregulation und DNA-Reparatur involviert ist. Ihre Fehlregulierung wurde mit verschiedenen Krankheiten wie Krebs in Verbindung gebracht. Trotz grçßter Wichtigkeit gibt es nur wenige Methoden, um PARylierung und ihre Dynamik in Zellen zu beobachten. Mittels einer chemisch-biologischen Herangehensweise entwickelten wir ein fluoreszierendes NAD + -Analogon, das sich als kompetitiver Baustein für die PARylierung von Proteinen in vitro und in Zellen erwies.D ies ermçglichte uns,d en Umsatz von PARd irekt und in lebenden Zellen nachD NA-Schädigung durchN IR-Mikrobestrahlung zu verfolgen. Zusätzlich wurden mithilfe von FLIM-FRET-Mikroskopie kovalente und nichtkovalente Interaktionen von PARm it ausgewählten Proteinen sichtbar gemacht. Unsere Ergebnisse erçffnen neue Chancen für die schnelle zelluläre Untersuchung der Protein-PARylierung in Echtzeit und werden somit zu einem besseren Verständnis und hçherer Aussagekraft im zellulären Kontext beitragen. Abbildung 1. Struktur von A) Poly(ADP-ribose) und B) NAD + und NAD + -Analoga 1 und 2,die in dieser Studie verwendet wurden.[ + + ]D iese Autoren haben zu gleichen Teilen zu der Arbeit beigetragen.Hintergrundinformationen zu diesem Beitrag sind unter: http://dx.

Poly(ADP-ribos)ylierung (PARylierung) ist eine wichtige posttranslationale Proteinmodifikation und ein bedeutender Signalweg in fast allen Eukaryoten. Grundlegende Prozesse,wie DNA-Reparatur und Transkription, werden von diesem kurzlebigen Polymer und seiner Wechselwirkung mit Proteinen gesteuert. ADP-Ribosyltransferasen (ARTs) erzeugen komplizierte ADP-Riboseketten aus NAD + an diversen Akzeptorproteinen, weshalb die Erforschung der PARylierung auf molekularer Ebene anspruchsvoll ist. Hier präsentieren wir die Entwicklung bioorthogonal funktionalisierter NAD + -Analoga für die In-vitro-und In-cellulo-Detektion der PARylierung. Für die intrazelluläre Visualisierung der PARylierung, zeitgleichu nd in zwei Farben, eignen sich besonders an Position 2m odifizierte NAD + -Analoga. Diese geben Einblickindas Substratspektrum der ARTs und werden durch schnelles optisches sowiem ehrfarbiges Auslesen von PARylierungen zur Aufklärung der biologischen Funktionen dieser Prozesse beitragen.