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We found an elastolytic activity in the culture supernatant of Streptomyces sp. P-3, and the corresponding enzyme (streptomycetes elastase, SEL) was purified to apparent homogeneity from the culture supernatant. The molecular mass of purified SEL was approximately 18 kDa as judged by SDS-PAGE analysis and gel-filtration chromatography. Utilizing information from N-terminal amino acid sequencing of SEL and mass spectrometry of SEL tryptic fragments, we succeeded in cloning the geneencoding SEL. The cloned SEL gene contains a 726 bp ORF, which encodes a 241 amino acid polypeptide containing a putative signal peptide for secretion (28 amino acid) and pro-sequence (14 amino acid). Although the deduced primary structure of SEL has sequence similarity to proteins in the S1 protease family, the amino acid sequence shares low identity (< 31.5 %) with any known elastase. SEL efficiently hydrolyses synthetic peptides having Ala or Val in the P1 position such as N-succinyl-Ala-Ala-(Pro or Val)-Ala-p-nitroanilide (pNA), whereas reported proteases by streptomycetes having elastolytic activity prefer large residues, such as Phe and Leu. Compared of kcat/Km ratios for Suc-Ala-Ala-Val-Ala-pNA and Suc-Ala-Ala-Pro-Ala-pNA with subtilisin YaB, which has high elastolytic activity, Streptomyces sp. P-3 SEL exhibits 12-and 121-fold higher, respectively. Phylogenetic analyses indicate that the predicted SEL protein, together with predicted proteins in streptomycetes, constitutes a novel group within the S1 serine protease family. These characteristics suggest that SEL-like proteins are new members of the S1 serine protease family, which display elastolytic activity.

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Proteolytische Enzyme werden in immer stärkerem Maße als Hilfsmittel bei der Strukturaufklärung von Eiweißstoffen herangezogen, da es nur mit ihrer Hilfe gelingt, größere Peptidbruchstücke von Proteinen zu erhalten. Um jedoch bestimmte Peptidbindungen möglichst selektiv spalten zu können, ist es wünschenswert, Enzyme frei von Fremdproteasen zu besitzen. Auch kann die Spezifität der Enzyme nur an reinen Präparaten wirklich eindeutig untersucht werden.Für die Darstellung reiner Enzyme hat sich bereits in mehreren Fällen die kontinuierliche Papierelektrophorese bewährt. Arginase 1 und Trypsin 2 wurden nach diesem Verfahren von Graßmann und Mitarbeitern in reiner Form erhalten. In der vorliegenden Arbeit wird die elektrophoretische Reinigung von Elastase beschrieben.Erstmals 1949 berichteten B an g a und Balo 8 über ein Enzym in Pankreas, welches Elastin zu verdauen vermag, wozu Trypsin und Chymotrypsin nicht in der Lage sind 4 . In weiteren Versuchen gelang ihnen eine etwa 25fache Anreicherung 5 » e , Hall und Czerkawski 7 konnten das Enzym an AJuminiumoxyd-Cy-Gel etwa 40fach anreichern. Eine wesentlich weitergehende Reinigung bis etwa 250fach erzielten Lewis, Williams und Brink 8 . Ihre besten kristallisierten Präparate mit einer spezif. Aktivität von 110 Elastaseeinheiten 6 /mg enthielten nach elektrophoretischen Untersuchungen 9 etwa 80% Elastase. Ein kleiner Anteil davon wurde in der Tiselius-Elektrophorese abgetrennt und besaß eine Aktivität von 130 E.E./mg 8 .* Pankreatopeptidase E (3.4.4.7); vgl.Mischung der aktiven Fraktion mit verschiedenen anderen abgetrennten Eiweißfraktionen ergab jedoch keine Aktivitätssteigerung (vgl. Tab. 3).