Pala merupakan tanaman yang digunakan dalam industri makanan, obat-obatan, parfumdan kosmetik. Minyak atsiri biji pala diketahui memiliki kandungan senyawa 1,4-terpineol dansafrol yang diduga memiliki aktivitas sebagai antibakteri.Pemisahan senyawa 1,4-terpineol dan safrol dari minyak atsiri biji pala dilakukan denganmetode distilasi fraksinasi pengurangan tekanan dengan tekanan 95 mmHg pada suhu 200-225C֯. Analisis kandungan senyawa pada minyak atsiri biji pala dan hasil pemisahan dilakukandengan GC-MS dan uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi dan dilusi.Hasil analisis menunjukkan bahwa minyak atsiri biji pala mengandung 5 senyawadominan yaitu α-pinene, sabinene, 2-β-pinen, terpineol dan miristisin, hasil pemisahanmengandung 49,05% 1-4 terpineol dan 20,34% safrol. Hasil uji difusi menunjukkan bahwa minyakatsiri biji pala dengan konsentrasi 1,25% memiliki zona hambat sebesar 12,11 mm yang tergolongkuat, sedangkan hasil pemisahan dengan konsentrasi sama memiliki zona hambat 9,66 mm yangtergolong sedang. Hasil dilusi minyak atsiri pala dan hasil pemisahan memiliki zona bunuh yangsama pada konsentrasi 1,25%