ResumoFoi avaliada a atividade antimicrobiana de uma cultura probiótica comercial, o Lactobacillus acidophilus La5, frente ao crescimento de dois microrganismos patogênicos veiculados por alimentos, Escherichia coli e Staphylococcus aureus. O antagonismo da cultura probiótica in vitro foi avaliado utilizando tanto a Metodologia de Multicamadas quanto a de Difusão em Ágar. Os resultados demonstraram que a substância inibidora presente no sobrenadante é extracelular e difusível. O período de incubação da bactéria lática em caldo MRS, a 37ºC em condições de aerobiose, onde se obteve a maior produção de ácido lático (1,08 g/%) foi 72 horas, o qual demonstrou o menor valor de pH do sobrenadante (3,90), e os melhores resultados de inibição pelo método de difusão em ágar, com halos de inibição de 14,75mm e 15,0mm de diâmetro para E. coli e S. aureus, respectivamente. O composto inibidor não foi sensível à ação de enzimas proteolíticas e ao congelamento, mas foi totalmente inativado quando o sobrenadante foi neutralizado com solução de NaOH 1N. Os resultados obtidos sugerem que atividade inibidora observada foi decorrente da concentração de ácido lático e do baixo pH do meio de cultivo do microrganismo probiótico. Palavras-chave: Atividade antimicrobiana, Lactobacillus acidophilus, ácido lático, cultura probiótica AbstractThe antimicrobial activity of a commercial probiotic culture, Lactobacillus acidophilus (La5), was tested against two foodborne pathogens, Escherichia coli and Staphylococcus aureus. The antagonistic effect of the probiotic culture in vitro was performed by applying both Multilayer Agar Plate and Agar Well Diffusion methods. The results indicated that the inhibitory substance present on 72 hours culture broth supernatant was extracellular and diffusible. The incubation period of the lactic acid bacteria on MRS Broth, at 37ºC in aerobic conditions, for the highest lactic acid production (1,08 g/%) was 72 hours, which gave a minimum pH value of the supernatant (3,90) and the best inhibition results by the Well Diffusion Agar Assay, showing inhibition zone diameters of 14,75mm and 15,0mm for E. coli and S. aureus, respectively. The inhibitor compound was not sensitive to proteolytic enzyme and freezing, but was totally inactivated when the supernatant was neutralized with NaOH 1 N solution. The results suggest that the inhibitory activity was due to the lactic acid concentration and the low pH of the probiotic culture broth.