The length of the telomeric DNA and polymorphism of the TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) gene can be the basis for the development of molecular genetic markers for the productive traits of agricultural animals, in particular pigs. The purpose of the work was to analyze the databases of the primary structure of the pig TERT gene, to determine single nucleotide polymorphisms (SNPs), to develop a DNA system for animal typing based on the TERT gene. Samples of biomaterials (blood, bristles) for DNA typing were selected from the leading farms of Ukraine in groups of 4 breeds of pigs and hybrid animals. Isolation of DNA from biomaterial was carried out using the Chelex 100 reagent. Genotyping of animals by the telomerase locus was carried out on the basis of standard methods of polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). The alignment of nucleotide sequences during the analysis of the primary structure of the TERT gene was carried out using the MegaX software and the Blast service. Design of the structure of oligonucleotide primers for PCR was carried out using the computer program Primer3Plus. During the development of the method of pigs genotyping according to TERT gene, a database analysis was carried out regarding the primary structure of the gene, a region of the gene with a significant number of SNPs was identified, and oligonucleotide primers were designed for PCR amplification of this region of the gene. The study presents the conditions of amplification of the TERT gene fragment, its cleavage by restriction endonuclease RsaI at the location of SNP rs698799571, electrophoresis of the obtained restriction DNA fragments in an 8% polyacrylamide gel, and the genotypes of the animals are also determined. The developed DNA typing technique for the TERT gene was used to analyze its polymorphism in groups of 4 purebred pigs and a group of hybrid anjmals. Monomorphic homozygous TERTAA genotype was present in purebred pigs. The polymorphism of the TERT gene by SNP rs698799571 was detected in a group of pigs of the final Irish hybrid (LW x L) x Maxgro (TERTAT genotype). Considering the fact that studies on the telomerase gene and determination of the TERT polymorphism for SNP rs698799571 in pigs have not yet been conducted in Ukraine, the developed technique of DNA typing by the telomerase gene has a perspective for further determination of the distribution of alleles and genotypes in domestic and imported breeds, as well as in marker-associated selection.

У роботі наведена оцінка гібридних свиней за показниками відгодівельної продуктивності: (AGE100) – вік досягнення живої маси 100 кг та (ADG) – середньодобовий приріст, г/кг. У досліді були використані гібридні свині (велика біла × ландрас) × Maxgro. Свині ірландської селекції є основою виробництва свинини в умовах ТОВ НВП «Глобинський свинокомплекс» Полтавської області, де їх використовують у якості батьківської форми. Метою роботи було дослідити чи забезпечує розподілення алельних варіантів генів кандидатів відгодівельних ознак – катепсину D CTSD (g.70G>A) та рецептора меланокортину 4 MC4R (c.1426A>G) у вибірці гібридних свиней (велика біла×ландрас) термінальної лінії Maxgro, достатню генетичну мінливість для асоціативного аналізу з наступною маркерною селекцією. Для генотипування гібридного стада свиней, свині були розділені на дві групи. До першої групи відносилися некастровані свині (n=60), до другої групи – імунологічно кастровані свині (n=54). Виділення ДНК було проведено із щетини вуха свиней з використанням іонообмінної смоли Chelex-100. Для визначення впливу генів-маркерів на продуктивні якості свиней використовували метод ПЛР-аналізу з рестриктним гідролізом фрагментів. Обробку даних результатів ДНК-генотипування проводили за допомогою програмного забезпечення GenAlEX6. Імунологічно-кастровані свині (n=8) з мономорфним генотипом MC4RАА (ADG=0,846кг/138діб) переважають некастрованих свиней (n=7) за віком досягнення живої маси 100 кг на 9 діб. Аналогічна ситуація спостерігається у свиней 2-ї та 1-ї групи з генотипом МC4RGG з незначною різницею у ADG+0,010 кг та AGE100 + 8 діб (ADG=0,756 кг/152 діб). Різниця у 6 діб за показником AGE100 спостерігається у свиней 1-ї групи з поліморфним генотипом MC4RAG (ADG=0,850 кг/150 діб) та ADG-0,198 кг. Імунологічно-кастровані свині (n=5) з генотипом CTSDGG переважають некастрованих (n=9) за середньодобовим приростом 0,851 кг на 0,076 кг. і віком досягнення живої маси 100 кг/158 діб на -14 діб, ніж некастровані (ADG=0,851кг/144діб). Свині з генотипом CTSDGA (n=27) 1-ї та 2-ї групи (n=18) характеризуються рівномірним ростом за період відгодівлі за показниками ADG і AGE100. Були виявлені обидва алелі за локусом рецептора меланокортину 4 MC4R (c.1426A>G) та катепсину D CTSD (g.70G>A). В SNP CTSD частота алеля G (0,576) вище за частотою алеля А (0,428). У випадку SNP MC4R алель А (0,554) вище за частотою алеля G (0,446). Отриманні дані дозволили змоделювати схему: «Генотиповий аналіз та прогнозування бажаних генотипів у нащадків батьківської форми свиней (велика біла × ландрас) термінальної лінії Maxgro (n=104) за SNPs CTSD та MC4R». ДНК-типування за SNPs MC4R (c.1426 A>G) та CTSD (g.70 G>A) виявило їх перспективне використання у маркер-асоційованій селекції. Вперше в Україні розпочато вивчення розподілення частот та асоціацій зазначених алелей і генотипів серед свиней термінальної лінії Maxgro. Перспективою є продовження досліджень у напрямку комплексного аналізу впливу досліджуваних генів на відгодівельні якості фінальних гібридів за використання термінальної лінії Maxgro. Запропоновано схему генотипового аналізу, що є фундаментальним напрямом для практичного впровадження маркерної селекції у виробничих умовах промислового свинарства України. Дослідження виконано за підтримки Національної академії аграрних наук України 31.01.00.07.Ф. «Дослідити плейoтропний ефект генів, SNP яких використовують в маркер-асоційованій селекції свиней» ДР № 0121U109838.

In the study, we evaluated the genetic specificity of haplotypes in the population of hybrid gilts (Large White × Landrace), (Landrace × Large White) from the SPE “Globinsky Pig Complex” LLC and breeding sows of the Large White breed from the SE “DG named after January 9th” using polymorphism of the lengths of the restricted fragments of mtDNA. The purpose of the study was to determine if the process of creating specialized parent lines (of modern cross-border breeds) reduces haplotype diversity. As a genetic material, bristles from sows of the Large White breed (n=7) were used and epithelial tissue of pigs (Large White × Landrace), (Landrace × Large White) — (n=37). DNA release from bristle samples was carried out using ion exchange resin Chelex-100. For the study of the D-loop of the mitochondrial genome of hybrid pigs (n=37) from the epithelial tissue of the auricle, a set of DNA-sorb-B nucleic acid extraction kit from “InterLabService-Ukraine” LLC was used. The samples of epithelial tissue of pigs’ ears were treated with fire from fuel tablet. For the analysis of the mitochondrial genome, the method of polymorphism of the lengths of restricted fragments was used, amplified with PCR. Genotyping of DNA samples of experimental pigs according to mitochondrial markers was carried out with the involvement of the polysite method in accordance with the methodological recommendations of K. F. Pochernyaev and M. D. Berezovsky (2014). The use of maternal inheritance type markers (mtDNA) allowed to identify 2 maternal lines with specific haplotypes, which participated in the creation of hybrid pigs and the formation of their haplogroup. The genetic diversity of mtDNA subspecies of wild and domesticated pigs is limited by the existing lines. Therefore, one haplotype of the mitochondrial genome does not indicate a specific breed, since, several breeds have the same haplotype mtDNA — A, G, C, N, and O. The concentration of haplotype A in tribal sows of Large White breed with a frequency (16%). In the hybrid gilts (Large White × Landrace), (Landrace × Large White) the concentration of detected haplotypes is: C (n=9) — Landrace, Hampshire, Wales, wild pig (20.5%); G — (n=5) Wales, wild pig (11.4%); O (n=5) — Landrace, wild pig (11.4%); N (n=11) — Large White, Berkshire, Asian wild pig (25%); D 9%, K 6.8% (n=7) — unknown among the breeds of domestic pig. We assume that pigs of a Large White breed with haplotype A and hybrid pigs (Large White × Landrace), (Landrace × Large White) with haplotype G, O, in particular D, K contain aboriginal genetic resources. However, in the middle of the XX century, subspecies of wild and domesticated pig breeds became less population-like due to decrease in the area of cultivation and increased pressure from foreign breeds with high growth rates and breeding grounds. Thus, there is a risk of extinction — existing haplotypes and those which have not yet been identified among domesticated pigs (D, K). This suggests that the study should focus on classifying and identifying the phylogenetic origin of pigs and the creation of a molecular genetic bank of producer boars for environmental activities. The domestication process puts strong selective pressure on Sus scrofa species through genetic processes such as inbreeding, genetic drift, natural and artificial selection according to the desired signs. Over the past 9–10,000 years, human intervention has led to domesticated species that are morphologically, behaviorally, and genetically different from their ancestors’ relatives. We believe that the “hybrid” subspecies of wild pigs with some morphological features of a domesticated pig had a higher proportion of the full-genomic ancestors of a domestic pig compared to the morphologically pure subspecies of wild pigs. Animals with haplotypes D, K are the result of hybridization with European boars. Representatives of haplotypes A (Large White, European-type Duroc, Mangalica); G (Wales, wild pig) — Italy; C (Landrace, Wales, Hampshire, wild pig) — Ukraine, Poland, France; O (landrace, wild pig) — Sweden, grouped into the European cluster of “mt-E” haplogroup. Pigs with the haplotype N — Large White (Asian type), Berkshire, a wild pig belongs to the Asian cluster of “mt-A” haplogroup. Over time, this led to almost complete disappearance of primary Middle Eastern ancestors in the nuclear genomes of European domesticated pigs. Phylogenetic reconstruction of mitochondrial genome data from hybrid pigs reflects a clear geographical division of mtDNA data — Eastern Europe and Asia. In particular, the subspecies of European and Asian wild pigs is the ancestral foundation on the maternal line, which preceded domestication and breeding pigs by hybridization. European and Asian haplotypes of wild pigs have shown that wild pigs from regions such as Italy, Poland, France, Scandinavia, and Ukraine were also either domesticated or at least initially included in domesticated pigs. The results of the study of the S. s. domestica mitochondrial genome showed an intra-breed genetic diversity of hybrid gilts. This is due to the selection strategy of international genetic centers, where, despite the consolidation of the genetic structure in the inside of the center, significant general genetic diversity of the breed is ensured. In addition, the above results indicate a connection between the frequency distribution of mtDNA haplotypes and adaptation to different climate conditions. As a whole, the presented results are an incentive to continue research on the study of the mitochondrial genome of modern lines of hybrid pigs. Carriers of haplotype C, O, G, and N are the basis of maternal breeding and improvement of the lines of hybrid pigs of the XXI century. It is necessary to take into account the fact that the cleanest mother nuclei (Wild pig, Great Yorkshire, Landrace) are really clean foundation for use in hybridization schemes, in the crossing over, in the formation and development of modern hybrid lines of pigs. Despite this, the diversity of the mitochondrial genome in the population of transboundary breeds persists.

L’objectif de cette étude était de caractériser la diversité génétique des porcs hybrides de (Large White × Landrace) × Maxgro en Ukraine. Présentation des résultats du typage ADN de porcs hybrides de (Large White × Landrace) × Maxgro de LLC SPE « Globinsky pig complex ». En utilisant l’analyse PCR-RFLP du polymorphisme de la boucle-D de l’ADN mitochondrial, 7 haplotypes mitochondriaux ont été identifiés – C, D, E, G, K, N, O. Dans un échantillon de porcs hybrides (n=37), la concentration déterminée d’haplotypes (%). Il a été établi que les haplotypes mitochondriaux qui ont été identifiés С (23%) – sont caractéristiques des porcs Landrace, Hampshire, Pays de Galles (Wales), cochon sauvage (Ukraine, Pologne); haplotype O (12,8 %) - inhérent au cochon sauvage et à la race Landrace (Suède); haplotype G (12,8 %) - propre à la race du Pays de Galles, cochon sauvage (Italie); haplotype N (28%) - caractéristique de la Large White race de porcs, les représentants sont porteurs de type asiatique. Il convient de noter que l’haplotype asiatique N est caractéristique du cochon sauvage asiatique et de la race Berkshire. Les données sur l’hybridation des génomes mitochondriaux d’origine asiatique et européenne sont présentées - est la base de la création de lignées modernes de porcs hybrides sur la lignée maternelle. Les porcs atteints de l’haplotype N appartiennent à l’haplogroupe A(D) et les porcs avec haplotype C, O, G appartiennent à l’haplogroupe E (E1 et E2). Il est possible que les haplotypes D (10,26%), E (5,13%), K (7,70%) appartiennent à l’haplogroupe A(D). Les porcs sauvages de type asiatique avec l’haplotype N appartiennent à l’haplogroupe A. Yorkshire et Berkshire appartiennent aux subhaplogroups D1a1 et D1b, D1e, D3 - confirmant la contribution maternelle des porcs asiatiques indigènes aux races modernes occidentales. Il s’est avéré que l’haplogroupe E chez les porcs hybrides est dominant, cependant, l’haplogroupe A est le précurseur de l’haplogroupe E. Je suppose que les porcs de grande race blanche avec haplotype N, D, E, K – contiennent des ressources génétiques autochtones. Porcs avec haplotype D, E, K - sont le résultat d’une hybridation avec des sangliers européens. Au fil du temps, cela a conduit à la disparition presque complète des principaux ancêtres du Moyen-Orient dans les génomes nucléaires des porcs européens domestiqués. Hypothèse selon laquelle l’élevage bovin saisonnier traditionnel, migrations annuelles à longue distance qui ont eu lieu dans le passé et le commerce des noyaux, expliquer le régularité observé de flux génétique favorable chez les porcs hybrides. Toutefois, je ne peux exclure la possibilité que les porcs asiatiques ont été directement impliqués dans la création de ou croisement ultérieur avec des races locales de porcs d’Ukraine. Le travail a été fait avec le soutien de l’Académie nationale des sciences agraires de l’Ukraine 31.01.00.07.F. « Étudier l’effet pléiotropique des gènes le SNP utilisés dans Sélection Assistée par Marqueurs de porcin » DR № 0121U109838.

У статті наведено спосіб підтвердження трансфікованності чужорідної ДНК, що призводить до змішаного ДНК-профілю досліджуванного об’єкта. Встановлення ДНК-профілю – це процес в котрому відповідний зразок ДНК, отриманий від свині (тканина, кров, щетина, тощо.) піддається дослідженню на встановлення походження праматеринських порід досліджуванних свиней. Не дивлячись на те, що Sus scrofa є унікальним біологічним об’єктом, більша частина ДНК насправді ідентична до ДНК інших представників Sus scrofa. Однак, саме конкретні регіони полісайтової системи вказують на відмінність між породами представників підвидів дикої свині та одомашненої, що свідчить про внутріпородний поліморфізм мітохондріального геному. Кожен представник Sus scrofa успадковує унікальну комбінацію поліморфізмів від батьків. З огляду на це, метою дослідження стало провести валідацію результатів генотипування свиней з використанням поліморфізму маркерів мітохондріальної ДНК, проаналізувати отриманні данні для ідентифікації профілю ДНК гібридних свиней (велика біла × ландрас) × Maxgro. Типування ДНК для ідентифікації мітохондріального геному гібридних свиней проводено шляхом дослідження зразків щетини (n=9) та епітеліальної тканини (n=28) з вуха свиней. Виявленні слідові відбитки дають об’єктивне свідчення, що дозволяє охарактеризувати відбитки трупної ДНК від інших біологічних об’єктів, виявлених на «місці злочину» при відборі зразків під час забою свиней на м’ясокомбінаті «Глобино». Виділення ДНК з щетини проводили з використанням іонообмінної смоли Chelex-100. Однак, підтвердити результати генотипування не вдалося, у зв’язку з тим, що у досліджуваних зразках при забої на м’ясокомбінаті були виявлені відбитки чужорідної ДНК. Про це свідчить високочуттєвий метод ПЛР-аналізу та гідроліз ендонуклеазою TasI досліджуваного варіабельного сайту D-петлі мтДНК гібридних свиней, отриманий хибно-позитивний результат елоктрофореграми показав змішані ДНК-профілі. Перед виділенням ДНК із епітеліальної тканини вуха свиней, досліджувані зразки були піддані обробці вогнем із сухого спирту. Виділення ДНК із епітеліальної тканини проводили сорбентним методом з використанням набору реагентів «ДНК-сорб-Б». Ідентифіковані наступні гаплотипи: 9 свиней з гаплотипом C – підвид дикої свині, ландрас, гемпшир, уельс (Україна, Польща, Франція); 5 свиней є представниками підвиду диких свиней, порід велика біла, уельс (Італія) з гаплотипом G; 5 свиней є носіями гаплотипу O – ландрас, дика свиня (Швеція) згруповані до європейського кластеру гаплогрупи E (E1 та E2); 11 свиней з гаплотипом N є представниками великої білої породи та дикої свині азійського типу, відносяться до азійського кластеру A(D). Отже, важливим фактором, що визначає валідацію результатів генотипування свиней за допомогою мітохондріальних ДНК-маркерів є не скільки метод екстрагування ДНК, а істинний у чистоті досліджуванний зразок господаря для встановлення чіткої експертизи мітохондріального геному.