No abstract

В настоящей работе были исследованы кривые затухания флуоресценции бензтиазольного красителя тиофлавина Т (ThT) в водно-глицериновых смесях в условиях макромолекулярного краудинга, имитирующих клеточную среду, и в амилоидных фибриллах на основе инсулина и фрагмента дрожжевого прионного белка Sup35 (Sup35NM). Показано, что анизотропия флуоресценции свободного красителя в растворах с высокой вязкостью в присутствии краудинг-агентов и встроенного в амилоидные фибриллы имеет предельно высокое значение и практически не отличается от анизотропии флуоресценции ThT в водном растворе. При этом времена затухания флуоресценции ThT, связанного с фибриллами на основе инсулина и Sup35NMp, различаются между собой и на несколько порядков превышают время жизни флуоресценции красителя в водных растворах. Сделано предположение о том, что результаты обусловлены молекулярно-роторной природой красителя. На основании данных работы сделано заключение о том, что измерение времени жизни возбужденного состояния ThT (но не анизотропии его флуоресценции) может быть использовано для исследования кинетики образования амилоидных фибрилл и их полиморфизма.

В настоящей работе был проведен анализ существующих в литературе гипотез об агрегации молекул флуоресцентного зонда тиофлавина Т (ThT) в свободном состоянии и при взаимодействии c амилоидными фибриллами. Экспериментально показана способность ThT образовывать эксимеры в водном растворе при высокой концентрации красителя. Проведено сравнительное изучение фотофизических характеристик ThT в мономерной и агрегированной формах и красителя, связанного с амилоидными фибриллами на основе лизоцима. Полученные результаты позволили показать необоснованность предположений о том, что изменение фотофизических характеристик ThT при встраивании в амилоидные фибриллы обусловлено агрегацией молекул красителя. Получено подтверждение мономерной модели связывания ThT с амилоидными фибриллами и сделано заключение о том, что возрастание квантового выхода флуоресценции ThT при встраивании в фибриллы обусловлено только молекулярно-роторной природой красителя (ограничением подвижности фрагментов ThT относительно друг друга за счет увеличения жесткости его микроокружения).

В настоящей работе исследованы фотофизические свойства нового аналога флуоресцентного зонда тиофлавина Т (ThT), транс-2-[4-(диметиламино)стирил]-3-этил-1,3-бензотиазолия перхлората (DMASEBT), в свободном состоянии в водных растворах и при связывании с амилоидными фибриллами. Получено подтверждение стабильности красителя в широком диапазоне pH раствора, в том числе в условиях получения исследуемых амилоидных фибрилл. С использованием специально разработанного подхода, основанного на спектроскопическом исследовании образцов, подготовленных методом равновесного микродиализа, показано, что встраивание DMASEBT в амилоидные фибриллы на основе инсулина приводит к длинноволновому сдвигу спектра его поглощения, а также к значительному возрастанию квантового выхода и времени затухания флуоресценции красителя. Кроме того, показано, что константы связывания ThT и DMASEBT с амилоидными фибриллами на основе инсулина имеют один и тот же порядок. На основании полученных результатов сделано заключение: DMASEBT обладает свойствами молекулярного ротора (что является ключевым моментом для флуоресцентного зонда), имеет сходный с ThT механизм взаимодействия с амилоидными фибриллами и улучшенные по сравнению с ThT спектральные характеристики, сдвинутые в область «окна прозрачности» биологических тканей; DMASEBT является перспективным диагностическим агентом для изучения амилоидных фибрилл.