Combinatorial libraries of rearranged hypervariable V(H) and V(L) sequences from nonimmunized human donors contain antigen specificities, including anti-self reactivities, created by random pairing of V(H)s and V(L)s. Somatic hypermutation of immunoglobulin genes, however, is critical in the generation of high-affinity antibodies in vivo and occurs only after immunization. Thus, in combinatorial phage display libraries from nonimmunized donors, high-affinity antibodies are rarely found. Lengthy in vitro affinity maturation is often needed to improve antibodies from such libraries. We report the construction of human Fab libraries having a unique combination of immunoglobulin sequences captured from human donors and synthetic diversity in key antigen contact sites in heavy-chain complementarity-determining regions 1 and 2. The success of this strategy is demonstrated by identifying many monovalent Fabs against multiple therapeutic targets that show higher affinities than approved therapeutic antibodies. This very often circumvents the need for affinity maturation, accelerating discovery of antibody drug candidates.

'Stacking hybridization reactions' wherein two or more short DNA oligomers hybridize in a contiguous tandem orientation onto a longer complementary DNA single strand have been employed to enhance a variety of analytical oligonucleotide hybridization schemes. If the short oligomers anneal in perfect head-to-tail register the resulting duplex contains a nick at every boundary between hybridized oligomers. Alternatively, if the short oligomers do not hybridize precisely in register, i.e. single strand regions on the longer strand are left unbound, gaps are formed between regions where short oligomers bind. The resulting gapped DNA duplexes are considerably less stable than their nicked duplex analogs. Formation of base pair stacking interactions between neighboring oligomers at the nicks that do not occur in gapped duplexes has been proposed as the source of the observed added stability. However, quantitative evidence supporting this hypothesis for DNA has not been reported. Until now, a direct comparison of the thermodynamics of DNA nicks versus DNA gaps has not been performed. In this communication we report such a comparison. Analysis of optical melting experiments in a well defined molecular context enabled quantitative evaluations of the relative thermodynamic difference between nicked and gapped DNA duplexes. Results of the analysis reveal that a nick may be energetically favored over a gap by at least 1.4 kcal/mol and perhaps as much as 2.4 kcal/mol. The presence of a 5'phosphate at a nick or gap fails to significantly affect their stabilities.

Effects of different end sequences on stability, circular dichroism spectra (CD), and enzyme binding properties were investigated for six 22-base pair, non-self-complementary duplex DNA oligomers. The center sequences of these deoxyoligonucleotides have 8-14 base pairs in common and are flanked on both sides by sequences differing in context and A-T content. Temperature-induced melting transitions monitored by differential scanning calorimetry (DSC) and ultraviolet absorbance were measured for the six duplexes in buffered 115 mM Na(+) solutions. Values of the melting transition enthalpy, DeltaH(cal), and entropy, DeltaS(cal), were obtained directly from DSC experiments. Melting transition parameters, DeltaH(vH) and DeltaS(vH), were also estimated from van't Hoff analysis of optical melting curves collected as a function of DNA concentration, assuming a two-state melting transition. Melting free energies (20 degrees C) of the six DNAs evaluated from DSC experiments ranged from -18.7 to -32.7 kcal/mol. van't Hoff estimates of the free energies ranged from -18.5 to -48.0 kcal/mol. With either method, the trends in free energy as a function of sequence were identical. Equilibrium binding by BamHI restriction endonuclease to the 22-base pair DNAs was also investigated. The central eight base pairs of all six molecules, 5'-A-GGATCC-A-3', contained a BamHI recognition sequence bounded by A-T base pairs. Magnesium free binding assays were performed by titering BamHI against a constant concentration of each of the deoxyoligonucleotide substrates and analyzing reaction products by gel retardation. Binding isotherms of the total amount of bound DNA versus protein concentration were constructed which provided semiquantitative estimates of the equilibrium dissociation constants for dissociation of BamHI from the six DNA oligomers. Dissociation constants ranged from 0.5 x 10(-)(9) to 12.0 x 10(-)(9) M with corresponding binding free energies of -12.5 to -10.6 (+/-0. 1) kcal/mol. An inverse relationship is found when binding and stability are compared.

ВВЕДЕНИЕВ последние годы для терапии ВИЧ в клинической практике используются более 30 лекарственных препаратов, которые в зависимости от механизма действия делятся на классы, включающие ингибиторы обратной транскриптазы, протеазы, интегразы и ингибиторы проникновения (слияния) [1][2][3][4][5][6]. Однако высокая генетическая изменчивость ВИЧ-1 приводит к выработке устойчивости (резистентности) к определенному препарату через некоторое время после начала его применения [7]. С 1996 года для лечения ВИЧ-инфекции широко используется метод высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) [7], основной целью которого является преодоление устойчивости вируса к отдельным антиретровирусным препаратам на основе комбинации высокоактивных лекарственных средств, обладающих различными механизмами действия. В настоящее время ВААРТ формирует методологическую основу лечения больных с ВИЧ-инфекцией [7]. Применение ВААРТ значительно увеличило продолжительность жизни ВИЧ-инфицированных пациентов и повысило ее качество, снизило количество летальных исходов, уменьшило частоту развития СПИДа и ассоциированных с ним состояний [7,8]. Тем не менее, стандартные схемы ВААРТ имеют ряд серьезных недостатков, к числу которых в первую очередь следует отнести ** andrianov@iboch.bas-net.by

Аннотация. Осуществлен виртуальный скрининг новых анти-ВИЧ агентов -потенциальных пептидомиметиков клеточного рецептора CD4 -и проведена оценка их ингибиторной активности методами молекулярного моделирования. В результате выполненных исследований идентифицированы пять химических соединений, проявляющих, согласно расчетным данным, высокое сродство к CD4-связывающему участку белка gp120 ВИЧ-1 -функционально консервативному эпитопу оболочки вируса. В связи с этим найденные соединения рассматриваются как потенциальные ингибиторы проникновения ВИЧ-1 с широким спектром нейтрализующего действия. Ключевые слова: ВИЧ-1, белок gp120, клеточный рецептор CD4, пептидомиметики, виртуальный скрининг, компьютерное моделирование, анти-ВИЧ агенты ВВЕДЕНИЕВнедрению ВИЧ-1 в макрофаги и Т-лимфоциты предшествует связывание белка gp120 оболочки вируса c первичным рецептором CD4 клеточной мембраны, а также с хемокиновыми корецепторами CCR5 и/или CXCR4, взаимодействие с которыми активирует процесс слияния мембран, ведущий к проникновению вирусного генома в клетки-мишени (см., например, обзорные статьи [1-4]). При этом содержимое вирусной частицы проникает в цитоплазму клетки, где начинается процесс синтеза молекулы ДНК по шаблону вирусной РНК с участием фермента обратной транскриптазы [5]. Затем комплекс, состоящий из синтезированной ДНК и ряда вирусных и клеточных белков, проникает в ядро клетки-хозяина, где под действием вирусного фермента интегразы провирусная ДНК встраивается в ДНК хромосом [6]. В такой интегрированной форме, называемой провирусом, ВИЧ-1 может оставаться от нескольких часов до нескольких лет, прежде чем перейдет к следующей стадии жизненного цикла -транскрипции [7]. Транскрипция генома ВИЧ-1 находится под контролем белков Tat и Rev вируса, а также факторов транскрипции ДНК клетки-хозяина [8]. Транскрибированная пре-мРНК подвергается частичному или полному сплайсингу, либо транспортируется из ядра в неизмененном виде. Из образованной таким образом мРНК на рибосомах клетки синтезируются различные вирусные белки, после чего на плазматической мембране происходит сборка новых вирусных частиц [9]. andrianov@iboch.bas-net.by