A Method to Monitor the Introduction of Posttranscriptional Modifications in tRNAs with NMR Spectroscopy

Gato, Alexandre; Catala, Marjorie; Tisné, Carine

doi:10.1007/978-1-0716-1374-0_19

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“…For instance, in the simple case where m 1 A58 would be introduced before m 5 Cs, there could not be any observable effect of m 5 Cs on the introduction of m 1 A58. In order to investigate whether this positive effect remains in a cellular context, we undertook to apply our recently developed methodology (38,39) to the monitoring of m 1 A58 introduction in tRNA i Met in yeast extracts. As seen above, the imino signals of G18 and U55 constitute an NMR signature of a properly folded elbow structure, and therefore can be regarded as an indirect marker of m 1 A58 introduction in the case of tRNA i Met .…”

Section: Resultsmentioning

confidence: 99%

“…In addition, previous time-resolved NMR study of tRNA Phe in pus4Δ and trm2Δ yeast extracts pointed towards the m 1 A58 incorporation being more affected by Ѱ55 than by T54, which is perfectly in line with the kinetic data reported here. This indicates that the time-resolved NMR approach we have developed in cellular extracts (39), is not only reliable to identify cross-talks between modifications, but also to discriminate between weak and strong dependencies.…”

Section: Discussionmentioning

confidence: 99%

“…Imino resonances of the m 1 A58-tRNA i Met were assigned using 2D jump-and-return-echo ( 1 H, 1 H)-NOESY (83,84) and 2D ( 1 H, 15 N)-BEST-TROSY (85) experiments. For monitoring the maturation of tRNA i Met in yeast extract, wild-type and trm4Δ yeast extracts were prepared in the c13-ABYS-86 background, as previously described (39). NMR spectra were measured at 30°C with unmodified 15 N-[U/G]-labelled tRNA i Met at 40 μM in yeast extracts supplemented with NaH2PO4/K2HPO4 pH 6.5 150 mM, NH4Cl 5 mM, MgCl2 5 mM, DTT 2 mM, EDTA 0.1 mM, SAM 4 mM, ATP 4 mM, NADPH 4 mM, and D2O 5% (v/v) (86).…”

Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

“…One of such circuits in the tRNA core involves modifications from the T-loop of yeast tRNAs. Using NMR spectroscopy to monitor the maturation of tRNAs in a time-resolved fashion in yeast extract (39), we previously identified a sequential order in the introduction of T54, Ψ55 and m 1 A58 in yeast tRNA Phe , with Ψ55 being introduced first, then T54 and finally m 1 A58 (38). Following a reverse genetic approach, we uncovered a cross-talk between these three modifications, with the m 1 A58 modification strongly depending on the two others.…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

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Different modification pathways for m¹A58 incorporation in yeast elongator and initiator tRNAs

Yared

Yoluç

Catala

et al. 2022

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As essential components of the cellular protein synthesis machineries, tRNAs undergo a tightly controlled biogenesis process, which include the incorporation of a large number of posttranscriptional chemical modifications. Maturation defaults resulting in lack of modifications in the tRNA core may lead to the degradation of hypomodified tRNAs by the rapid tRNA decay (RTD) and nuclear surveillance pathways. Although modifications are typically introduced in tRNAs independently of each other, several modification circuits have been identified in which one or more modifications stimulate or repress the incorporation of others. We previously identified m1A58 as a late modification introduced after more initial modifications, such as Psi55 and T54 in yeast elongator tRNAPhe. However, previous reports suggested that m1A58 is introduced early along the tRNA modification process, with m1A58 being introduced on initial transcripts of initiator tRNAiMet, and hence preventing its degradation by the nuclear surveillance and RTD pathways. Here, aiming to reconcile this apparent inconsistency on the temporality of m1A58 incorporation, we examined the m1A58 modification pathways in yeast elongator and initiator tRNAs. For that, we first implemented a generic approach enabling the preparation of tRNAs containing specific modifications. We then used these specifically modified tRNAs to demonstrate that the incorporation of T54 in tRNAPhe is directly stimulated by Ѱ55, and that the incorporation of m1A58 is directly and individually stimulated by Ѱ55 and T54, thereby reporting on the molecular aspects controlling the Psi 55 to T54 to m1A58 modification circuit in yeast elongator tRNAs. We also show that m1A58 is efficiently introduced on unmodified tRNAiMet, and does not depend on prior modifications. Finally, we show that the m1A58 single modification has tremendous effects on the structural properties of yeast tRNAiMet, with the tRNA elbow structure being properly assembled only when this modification is present. This rationalizes on structural grounds the degradation of hypomodified tRNAiMet lacking m1A58 by the nuclear surveillance and RTD pathways.

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Section: Resultsmentioning

confidence: 99%

Section: Discussionmentioning

confidence: 99%

Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

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Different modification pathways for m¹A58 incorporation in yeast elongator and initiator tRNAs

Yared

Yoluç

Catala

et al. 2022

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“…In der Regel wird auch hierfür auf die chemische Festphasensynthese unter Verwendung Isotopen-markierter Phosphoramidite oder in vitro Transkription mit den entsprechenden Triphosphaten zurückgegriffen. [280,379,380] Auch die Untersuchung von tRNAs [381][382][383] und G-Quadruplexen [334,373,384,385] mittels NMR-Spektroskopie bringt wichtige Erkenntnisse über Faltungszustände und Stabilitäten dieser. So verglichen Biedenbänder et al kürzlich unmodifizierte tRNA fMet mit modifizierter tRNA fMet , um den lokalen und globalen Einfluss einzelner Modifikationen zu untersuchen.…”

Section: Die Vielfältigen Strategien Und Möglichkeiten Zur Nmr-spektr...unclassified

Chemo-enzymatische Synthese lichtaktivierbarer RNA & Synthese lichtregulierbarer Oligonukleotide zur spektroskopischen Strukturaufklärung

Blümler¹

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Das wachsende Verständnis für das fein abgestimmte Zusammenspiel aus Struktur und Funktion von Nukleinsäuren resultiert aus unzähligen Forschungsprojekten. Forschende stehen dabei vor der Herausforderung, dass die zu untersuchenden Oligonukleotide sowohl modifiziert als auch in ausreichender Menge und Reinheit dargestellt werden müssen. Die chemische Festphasensynthese ist ein bewährtes Mittel zur Synthese hochmodifizierter DNA und RNA. Allerdings werden Oligonukleotide mit zunehmender Länge unzugänglicher, da die einzelnen Kupplungsreaktionen nicht quantitativ ablaufen, was zu schwer abtrennbaren Abbruchsequenzen führt. Hinzu kommt, dass während der chemischen Synthese harsche Reaktionsbedingungen nötig sind, denen die gewünschten Modifikationen standhalten müssen. (Chemo-) enzymatische Methoden können diese Hürden überwinden und somit den Zugang zu biologisch interessanten, längeren modifizierten Sequenzen ermöglichen. Jedoch erfolgt der enzymatische Einbau von Modifikationen ohne aufwendige Optimierung lediglich statistisch verteilt. Um weitere Erfolge im Bereich der Strukturaufklärung zu erzielen, werden somit Synthesemethoden benötigt, die sich zum positionsspezifischen Einbau von Modifikationen eignen und gleichzeitig den Zugang zu längeren Oligonukleotiden ermöglichen. Zur Untersuchung der Zusammenhänge zwischen Struktur und Funktion haben sich in den letzten Jahren lichtadressierbare Verbindungen als gefragte Modifikationen erwiesen. Der Einsatz von Licht als mildes, nicht-invasives Auslösesignal stellt besonders im biologischen Kontext eine interessante Herangehensweise dar. Um hochwertige Aussagen über das Verhalten von Oligonukleotiden in komplexer biologischer Umgebung machen zu können, muss durch die gezielte Platzierung lichtaktivierbarer Verbindungen ein effizientes AN/AUS-Verhältnis geschaffen werden. Der Einbau photolabiler Schutzgruppen erlaubt eine vorübergehende Beeinflussung der Oligonukleotidstruktur, die durch Abspaltung der Schutzgruppe irreversibel (re-) aktiviert werden kann. Im Gegensatz dazu ermöglicht der Einbau von Photoschaltern eine reversible Adressierbarkeit durch Isomerisierungsprozesse. Die Synthese komplexer gezielt-markierter Oligonukleotide erfolgt zumeist chemisch und ist daher längenlimitiert. Ziel dieser Doktorarbeit war es, beide Fragestellungen zu vereinen und eine chemo-enzymatische Methode zur RNA-Synthese zu untersuchen, die zum einen die positionsspezifische Modifizierung mit lichtaktivierbaren Einheiten erlaubt und darüber hinaus die Längenlimitierung der chemischen Festphasensynthese überkommt. Im Zentrum der Methode stehen drei enzymatische Reaktionsschritte zum Einbau von photolabil- und photoschaltbar-modifizierten Nukleosid-3‘,5‘-Bisphosphaten: I) eine 3‘-Verlängerung, in der die modifizierten Bisphosphate mit T4 RNA Ligase 1 mit dem 3‘-Ende einer RNA verknüpft werden; II) die Dephosphorylierung des 3‘-Phosphats mit Shrimp Alkaline Phophatase und III) die Verknüpfung der 3‘-terminal modifizierten RNA mit einem zweiten 5‘-phosphorylierten RNA-Fragment, wodurch eine Gesamtsequenz mit gezielt platzierter Modifikation entsteht (Abb. I). Im ersten Teilprojekt wurden in kollaborativer Arbeit zunächst benötigte photolabile NPE- und photoschaltbare Azobenzol-C-Nukleosid-3‘,5‘-Bisphosphate synthetisiert und grundlegende Bedingungen der enzymatischen Reaktionen erarbeitet. Hierbei konnte der enzymatische Syntheseansatz erfolgreich in Lösung umgesetzt und der chemo-enzymatische Einbau aller synthetisierten Bausteine nachgewiesen werden. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen wurde die Methode in eigenständigen Arbeiten weiterverfolgt, um den multiplen Einbau NPE-modifizierter Nukleosid-3‘,5‘-Bisphosphate in direkter Nachbarschaft sowie deren Einbau in DNA/RNA-Mixmere mit Phosphodiester- oder Phosphorthioatrückgrat zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die verwendeten Enzyme neben lichtaktivierbaren Modifikationen zusätzliche Anpassungen der Phosphateinheit sowie unterschiedliche Ribosebausteine in Kombination tolerieren. Da exogene RNA schnell von Exonukleasen abgebaut und somit unwirksam wird, werden zahlreiche stabilisierende Anpassungen an synthetischen RNAs vorgenommen. Zu den häufigsten zählen Phosphorthioate und Modifikationen der Ribose. Mit der erfolgreichen Modifikation der chimären Oligonukleotide eröffnet die erarbeitete Methode einen wichtigen Zugang zu therapeutisch interessanten Oligonukleotiden. Ein weiterer wichtiger Schritt in Richtung biologisch relevanter Anwendungsmöglichkeiten konnte mit der Synthese, Charakterisierung und Umsetzung eines DEACM-geschützten Uridin-3‘,5‘-Bisphosphates (pUDEACMp) errungen werden. Im Vergleich zur verwendeten NPE-Schutzgruppe ist das Absorptionsspektrum der DEACM-Schutzgruppe bathochrom-verschoben, was eine Abspaltung mit Wellenlängen > 400 nm erlaubt. Dadurch können Zellschäden vermieden und Oligonukleotide mit NPE- und DEACM-Modifikation wellenlängenselektiv angesprochen werden...

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Imino chemical shift assignments of tRNAAsp, tRNAVal and tRNAPhe from Escherichia coli

Yared,

Chagneau,

Barraud

2024

Biomol NMR Assign

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Transfer RNAs (tRNAs) are an essential component of the protein synthesis machinery. In order to accomplish their cellular functions, tRNAs go through a highly controlled biogenesis process leading to the production of correctly folded tRNAs. tRNAs in solution adopt the characteristic L-shape form, a stable tertiary conformation imperative for the cellular stability of tRNAs, their thermotolerance, their interaction with protein and RNA complexes and their activity in the translation process. The introduction of post-transcriptional modifications by modification enzymes, the global conformation of tRNAs, and their cellular stability are highly interconnected. We aim to further investigate this existing link by monitoring the maturation of bacterial tRNAs in E. coli extracts using NMR. Here, we report on the 1H, 15N chemical shift assignment of the imino groups and some amino groups of unmodified and modified E. coli tRNAAsp, tRNAVal and tRNAPhe, which are essential for characterizing their maturation process using NMR spectroscopy.

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Different modification pathways for m¹A58 incorporation in yeast elongator and initiator tRNAs

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Chemo-enzymatische Synthese lichtaktivierbarer RNA & Synthese lichtregulierbarer Oligonukleotide zur spektroskopischen Strukturaufklärung

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