A Simple Competitive Protein-Binding Assay for Cyclic Adenosine 3´:5´-monophosphate

Abstract

A cyclic adenosine 3': 5'-monophosphate (Ado-3':5'-P) assay is proposed basing on the principle of competitive protein-binding. Free and bound Ado-3':5'-P is separatedjby coated (Dextran T 70, bovine serum albumine) charcoal. The Ado-3':5'-P binding protein is obtained from bull adrenals. The detection limit is 0.25 pmol in the incubation tube. The affinity constant of the protein-Ado-3': 5'-P complex is 2.8 • 10 8 l/mol. The free enthalpy is approximate lOkcal/mol. The high specificity is tested with other similar nucleotides. There is a great difference between the N 6-mono-and N 6-2'O-dibutyryl derivatives of Ado-3':5'-P with respect to their affinities for the binding protein, or protein kinase. The criteria of reliability are given by precision, detection limit, specificity and accuracy data. The method is suitable for serial determinations. One person is able to measure 100 samples (including the standard curve) per day. For linearisation of the dose response curve a new method is described. The proposed plot has the advantages of simplicity and ease of curve calculation. In addition, the plot yields the affinity constant and binding capacity of the binding protein. Moreover, this method allows the estimation of the affinity constant of any competitor of a labeled ligand. This method for linearisation is discussed regarding its limitations and advantages. Es wird eine Bestimmungsmethode für cyclisches Adenosin-3': S'-monophosphat (Ado-3': 5'-P) vorgeschlagen, die auf einer kompetitiven Verdrängungsreaktion von 3 H-und nichtmarkiertem Ado-3':5'-P an einem spezifisch Ado-3':5'-P bindenden Protein beruht, das aus Nebennieren von Stieren erhalten wird. Die Trennung von freiem und gebundenem Ado-3': 5'-P erfolgt durch mit Dextran T 70 und Rinderserumalbumin vorbehandelter Aktivkohle. Die Nachweisgrenze für Ado-3': 5'-P liegt bei 0,25 pMol (p ^ 0,05) im Bestimmungsansatz. Die Affinitätskonstante beträgt 2,8 • l O 8 l/Mol. Die freie Enthalpie für die Reaktion der Anlagerung von Ado-3':5'-P an das bindende Protein beläuft sich auf etwa 10 kcal/Mol. Die Spezifität der Methode ist hoch; ähnlich gebaute Nucleotide sind weitgehend ohne Einfluß auf die Reaktion. Für die beiden Ado-3': 5'-P-Derivate N 6-Mono-und N 6-2'O-Dibutyryl-Ado-3 / :5 /-P besteht ein großer Unterschied in der Affinität zum bindenden Protein bzw. der Proteinkinase. Die Zuverlässigkeit der Methode wird mit Daten für die Präzision, die Nachweisgrenze, die Spezifität und die Richtigkeit belegt. Die Methode ist für Serienbestimmungen geeignet; eine Assistentin kann etwa 100 Proben (einschließlich Standard-Kurve) am Tag messen. Zur Linearisierung der Dosis-Wirkungskurve wird eine neue Methode beschrieben, deren Vorteile und Grenzen diskutiert werden. Die vorgeschlagene graphische Darstellung erlaubt eine einfache Kurvenberechnung sowie die Ermittlung der Affinitätskonstante und der Bindungskapazität des Bindungsproteins. Darüberhinaus kann unter Verwendung nur eines markierten Liganden die Affinitätskonstante für jede kompetitiv wirksame Verbindung besti...

Cyclic AMP Levels in Cerebrospinal Fluid in Manic-Melancholic Patients

“…Cyclic AMP in unprocessed CSF was measured by a competitive protein-binding assay (Cooper et at., 1972) using a binding protein prepared as described by Wombacher and Koerber (1972). The cyclic AMP concen trations were expressed as picomoles cyclic AMP per milliliter.…”

Circadian responses of teleostean oocytes to gonadotropins and prostaglandins determined by cyclic AMP concentration

“…The proteins were quantified by the method described by Lowry et al (1951). The levels of cyclic AMP in each sample were measured by the protein binding assay method described by Wombacher and Korber (1971) The maximum accumulation of cyclic AMP in the mature oocytes of grey mullet was recorded for total levels of 15 fL9 LH or SG-G100. This level was comparable to the pituitary contents reported in N. crysoleucas, which ranged between 6.1-34.0 fL g of SG-G100 during the 24-hr cycle (de Vlaming and Vodicnik, 1977).…”

The Effect of Lithium on Unstimulated and Glucagon‐stimulated Urinary Cyclic AMP Excretion in Rat and Man

“…Cyclic AMP in rat urine was measured by a competitive protein binding assay (COOPER et al 1972) using a binding protein prepared as described by WOMBACHER & KOERBER (1972). In human investigations urinary cyclic AMP was determined with a protein binding assay using a binding protein prepared from rabbit skeletal muscle essentially as described by MIYAMOTO et al (1969).…”