Adeno-Associated Virus Type 2 Wild-Type and Vector-Mediated Genomic Integration Profiles of Human Diploid Fibroblasts Analyzed by Third-Generation PacBio DNA Sequencing

Abstract

Genome-wide analysis of adeno-associated virus (AAV) type 2 integration in HeLa cells has shown that wild-type AAV integrates at numerous genomic sites, including AAVS1 on chromosome 19q13.42. Multiple GAGY/C repeats, resembling consensus AAV Rep-binding sites are preferred, whereas rep-deficient AAV vectors (rAAV) regularly show a random integration profile. This study is the first study to analyze wild-type AAV integration in diploid human fibroblasts. Applying high-throughput third-generation PacBio-based DNA sequencing, integration profiles of wild-type AAV and rAAV are compared side by side. Bioinformatic analysis reveals that both wild-type AAV and rAAV prefer open chromatin regions. Although genomic features of AAV integration largely reproduce previous findings, the pattern of integration hot spots differs from that described in HeLa cells before. DNase-Seq data for human fibroblasts and for HeLa cells reveal variant chromatin accessibility at preferred AAV integration hot spots that correlates with variant hot spot preferences. DNase-Seq patterns of these sites in human tissues, including liver, muscle, heart, brain, skin, and embryonic stem cells further underline variant chromatin accessibility. In summary, AAV integration is dependent on cell-type-specific, variant chromatin accessibility leading to random integration profiles for rAAV, whereas wild-type AAV integration sites cluster near GAGY/C repeats.

Vector design influences hepatic genotoxicity after adeno-associated virus gene therapy

“…It is noteworthy that the Afp and Alb genes are tightly linked, which suggests that open chromatin, in the setting of active transcription and the vector itself, presents interacting factors that influence where an AAV vector integrates (39). While AAV is known to have a preference to integrate into actively transcribed genes (30), we are unaware of any reports that correlate higher tissue-specific gene expression with increased AAV integration frequency.…”

A Comprehensive RNA Sequencing Analysis of the Adeno-Associated Virus (AAV) Type 2 Transcriptome Reveals Novel AAV Transcripts, Splice Variants, and Derived Proteins

“…For the primers, see Table 1. AAV2 production, purification, and quantification. For AAV2 production, HEK 293 cells seeded at 30% confluence were transfected 24 h later with AAV plasmids and pHelper as described previously (18). AAV2 was purified from benzonase-treated, cleared freeze-thaw supernatants by one-step AVB Sepharose affinity chromatography and quantified by qPCR as described previously (19) with primers for AAV2 rep (Table 1).…”

Intégration des vecteurs AAV et mutagenèse insertionnelle

“…En effet, l'intégration de l'AAV sauvage peut avoir lieu dans une zone très étendue, en amont et en aval du site AAVS1, et entraîner des modifications profondes du génome cellulaire (délétions, duplications) ainsi que des délétions des extrémi-tés du génome viral. Il est ainsi impossible de connaître, a priori, les séquences virales présentes au niveau des jonctions avec l'ADN Figure 3A) [20][21][22]. Cela s'explique par la présence dans le génome cellulaire de nombreux sites RBS reconnus par les protéines Rep de l'AAV.…”

“…En effet, des expériences réalisées sur des cellules en culture avaient déjà montré que, bien qu'ayant perdu leur capacité d'intégration site-spécifique, les vecteurs AAVr peuvent s'inté-grer à un niveau faible, mais détectable, dans des gènes transcriptionnellement actifs [36]. Comme dans le cas de l'AAV sauvage, l'intégration des vecteurs AAVr dans des cellules en culture peut survenir dans plusieurs régions chromosomiques, mais les locus ciblés sont différents de ceux du virus sauvage ( Figure 3B) [22]. Il apparaît aussi que les sites d'intégra-tion de l'AAVr varient en fonction du type cellulaire ciblé confirmant la préférence de l'AAVr pour des régions transcriptionnellement actives qui dépendent du tissu d'origine de ces cellules [22].…”

“…Comme dans le cas de l'AAV sauvage, l'intégration des vecteurs AAVr dans des cellules en culture peut survenir dans plusieurs régions chromosomiques, mais les locus ciblés sont différents de ceux du virus sauvage ( Figure 3B) [22]. Il apparaît aussi que les sites d'intégra-tion de l'AAVr varient en fonction du type cellulaire ciblé confirmant la préférence de l'AAVr pour des régions transcriptionnellement actives qui dépendent du tissu d'origine de ces cellules [22]. De même, les expé-riences réalisées in vivo dans des foies de souris en régénération ont permis de montrer qu'environ 10 % des génomes AAVr étaient effectivement intégrés dans le génome cellulaire [35,37,38].…”