Eboni (Diospyros celebica Bakh.) merupakan salah satu pohon khas daerah Sulawesi. Serbuk kayu sebagai hasil sampingan dari pengolahan kayu ini belum dimanfaatkan secara maksimal. Hasil penelitian pendahuluan menyatakan bahwa ekstrak etanol serbuk kayu eboni memiliki aktivitas antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan pemisahan senyawa antibakteri yang terdapat di dalamnya dengan metode fraksinasi cair-cair menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat, n-butanol, dan air, serta pengujian aktivitas antibakteri dari fraksi-fraksi tersebut dengan metode disk diffusion dan KLT bioautografi. Identifikasi golongan senyawa dari fraksi aktif menggunakan pereaksi kromogenik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi n-heksan memiliki diameter hambat tertinggi terhadap Escherichia coli yakni sebesar 12,53 mm dengan golongan senyawa yang memiliki aktivitas penghambatan adalah steroid dan fraksi etil asetat memiliki diameter hambatan tertinggi terhadap Staphylococcus aureus yakni sebesar 14,77 mm dengan golongan senyawa yang memberikan zona hambat yaitu terpenoid, fenolik, steroid.