Efecto del co-cultivo sobre el desarrollo temprano de embiones bovinos producidos in vitro

Abstract

Objetivo. Estudiar el efecto del cocultivo con células oviductales sobre el porcentaje de clivaje 48 horas post inseminación (hpi) de embriones bovinos en bajas tensiones de oxígeno. Materiales y métodos. Se recolectaron ovarios de matadero para la extracción de los ovocitos que fueron puestos en medio TCM 199 suplementado con hormonas, se fertilizaron con semen criópreservado y se cocultivaron en medio CR1aa con células de oviducto durante 48 horas. Se evaluó el porcentaje de clivaje total y el porcentaje de clivaje por estadios de 2-4 células y 5-8 células. La viabilidad de las células para el cocultivo se determinó por observación del movimiento ciliar y observación de monocapa. Los tratamientos fueron T1: células de oviducto + oxígeno 20%; T2: células de oviducto + oxígeno 7%; T3 y T4 fueron controles sin células para ambas concentraciones de oxígeno. Resultados. En cuanto al porcentaje de clivaje no hubo diferencia significativa entre los cuatro tratamientos, pero hubo una tendencia a mayor clivaje para los embriones cocultivados con células y 20% oxígeno. Conclusiones. La utilización de altas tasas de oxígeno (20%) en los sistemas de cococultivo con células oviductales tienden a mejorar los porcentajes de clivaje a las 48 hpi.

Desarrollo embrionario bovino in vitro co-cultivado con células oviductales y del cumulus oophorus

“…La producción de embriones in vitro (PIVE), especialmente en el modelo bovino, ha sido motivo de múltiples investigaciones, pues aunque aproximadamente el 90% de los ovocitos alcanzan la metafase II y expulsan el primer cuerpo polar entre las 16 y 24 horas de comenzada la maduración, sólo el 80% es fecundado y comienzan a dividirse al menos hasta 2 y 4 células (Mucci et al, 2006). No todos son capaces de alcanzar la etapa de blastocisto, de manera que la tasa generalmente oscila entre 5 y 30% (Ahuja et al, 2009;López et al, 2007); lo que indica un estado crítico en la PIVE, ya que es aquí donde se define en gran medida la calidad de los embriones obtenidos. Mientras el número de blastocistos depende principalmente de la calidad de los ovocitos, la calidad de los blastocistos está determinada por el ambiente de cultivo (Ahuja et al, 2009;Havlicek et al, 2005).…”

“…Entre éstas se puede mencionar, la producción de compuestos con actividad mitogénica para las células embrionarias que favorecen la diferenciación celular, la eliminación o degradación de algunas sustancias embriotóxicas presentes en el medio de cultivo, así como la modificación en las concentraciones de algunos sustratos energéticos; no obstante, de igual manera existen evidencias que indican como consecuencia condiciones inapropiadas en el ambiente de cultivo (cambios en la composición del medio por alteraciones en los constituyentes, modificaciones en la atmósfera gaseosa, etc.) que conllevan a la liberación de sustancias embriotóxicas (Cordova et al, 2014;Fields et al, 2011;Goovaerts et al, 2010;Herradón et al, 2007;López et al, 2007;Orsi y Reischl, 2007;Urman y Balaban, 2005).…”

“…Los oviductos y ovarios fueron colectados de hembras bovinas adultas sacrificadas en un rastro local. Una vez recuperado el aparato reproductor se procedió a la disección rápida y cuidadosa de los ovarios y oviductos para posteriormente limpiarlos con solución salina al 0.9% adicionada con antibióticoantimicótico (Penicilina G 10000 UI/mL, Estreptomicina 10000 Ul/mL y Anfotericina 24 Ul/mL) y guardarlos en un termo conteniendo solución salina para evitar su deshidratación durante el transporte al laboratorio a una temperatura de 30-35 °C, dentro de un lapso de 2 a 3 horas (Ordoñez et al, 2014;Wang et al, 2012;Ahuja et al, 2009;George et al, 2008;López et al, 2007).…”

“…Antes de aislar y cultivar las células oviductales se lavaron los oviductos con PBS y el tejido que los rodeaba (ligamentos y grasa) fue removido, se lavó el lumen de los oviductos con 10 mL de PBS, para finalmente realizar una incisión longitudinal y exponer las células de la capa interior. Cuidadosamente se realizó un raspado con un escalpelo y las células separadas se colocaron en cajas Petri de 35x10 mm con 2 mL de TCM-199 suplementado con el 20% de SFB, cubierto con aceite mineral para su incubación (Cordova et al, 2014;Schoen et al, 2008;López et al, 2007;Walter y Miller, 1996;Goto et al, 1992).…”

“…Las células del cumulus oophorus fueron colectadas del líquido folicular posterior a la colección de los complejos cumulus-ovocito (COC's) (Goto et al, 1992), de las células precipitadas se tomaron 100 µL y colocaron en una caja Petri de 35x10 mm con 2 mL de TCM-199 suplementado con el 20% de SFB (Suero Fetal Bovino), cubierto con aceite mineral para su incubación dentro de un ambiente con 5% de CO 2 , 38.5 °C y 95% de humedad (López et al, 2007).…”