El objetivo de este trabajo fue aislar e identificar levaduras del lactosuero del queso Paipa y evaluar su potencial probiótico (in vitro) para su uso en alimentación animal. Las cepas se aislaron en caldo extracto de levadura-glucosa-cloranfenicol, se purificaron en agar PDA y se caracterizaron molecularmente. Se aislaron 10 cepas dentro de las que se encuentran Candida kefyr, Kluyveromyces marxianus, Pichia fermentans, entre otras. Las levaduras aisladas fueron evaluadas para evidenciar su uso potencial como probióticos en alimentación animal. Se determinó la resistencia a sales biliares (0,05, 0,1, 0,15, 0,20, 0,25 y 0,30 %), la estabilidad al pH del estómago (1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 y 4,0) y resistencia al jugo gástrico (pH 1,5, NaCl de 0,2 % y pepsina de 0,32 %). En la prueba con diferentes concentraciones de sales biliares, las mejores cepas fueron K. marxianus (30_4) y P. fermentans (28_5). En la prueba de pH, el mejor desempeño lo tuvieron P. marxianus (30_4) y Yarrowia lipolytica. Finalmente, en la prueba de jugos gástricos se destacaron C. kefyr y K. marxianus (R_1). Las cepas que presentaron buen desempeño en casi todas las pruebas fueron K. marxianus (30_4) y P. fermentans (28_5), de tal forma que estas levaduras aisladas del lactosuero de queso Paipa tienen potencial en la aplicación como probióticos en la alimentación animal.