den Naturstoffen findet sich eine Vielzahl biologisch aktiver Verbindungen mit elektrophilem Grundgerüst, die spezifisch mit nukleophilen Resten, wie Cystein und Serin, im aktiven Zentrum der entsprechenden Enzyme reagieren. [1][2][3] Die Reste sind hauptsächlich für die Katalyse von Reaktionen wichtig und bieten eine maßgeschneiderte Reaktivität gegenüber geeigneten Substraten.[4] Wir und andere erforschten bisher die Angriffsziele von monocyclischen bLactonen, die sich als potente und selektive Inhibitoren diverser krankheitsrelevanter Enzymklassen herausstellten. [2,3,[5][6][7][8] Im Falle der kovalenten Bindung und Inhibition der caseinolytischen Peptidase ClpP wurde eine drastische Verminderung der Virulenz von Bakterien festgestellt.[3] ClpP ist ein zentrales, hoch konserviertes Hitzeschockprotein mit zusätzlichen regulatorischen Funktionen in vielen pathogenen Bakterien. [9][10][11] Einige Organismen, wie Listeria monocytogenes, kodieren in ihrem Genom zwei ClpP-Isoformen (ClpP1 und ClpP2), deren Funktion und Struktur noch nicht charakterisiert wurden. Bisher wurde ausschließlich ClpP2 als Angriffsziel der b-Lactone beschrieben.[2] Es ist daher mçg-lich, dass es monocyclischen b-Lactonen an entsprechender Reaktivität fehlt, um mit dem nukleophilen aktiven Zentrum von ClpP1 zu reagieren. In unseren hier vorgestellten Studien haben wir den Rahmen der von Naturstoffen inspirierten b-Lactone zu einem gespannten bicyclischen Ringsystem erweitert, das eine hçhere Reaktivität aufweisen kçnnte. Die Naturstoffe Omuralid, Salinosporamid und Vibralacton (VL) stellen solch ein Strukturgerüst dar und wurden bisher als Proteasom-oder Lipase-Inhibitoren beschrieben. [12][13][14] Wir nutzen hier eine kombinierte Strategie aus Proteomik und biologischer Chemie, genannt "aktivitätsbasiertes Protein-Profiling (ABPP)", [15][16][17] um nachzuweisen, dass VL, im Unterschied zu monocyclischen b-Lactonen, zu beiden ClpP-Isoformen (ClpP1 und ClpP2) in L. monocytogenes eine Affinität aufweist. Außerdem war es in Kombination mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Homologie-Modellierung und Strukturvorhersage mçglich, die quartäre Struktur des heterooligomeren Komplexes aufzuklären (Abbildung 1).VL wurde nach Zhou und Snider [18] synthetisiert (Schema 1 der Hintergrundinformationen) und im letzten Schritt mit einem Alkinmarker, der die Identifizierung der Angriffsziele durch ABPP ermçglicht, zur Sonde modifiziert (Abbildung 1).[19] Dabei wurden zunächst lebende Zellen von L. welshimeri und dessen pathogenem Pendant L. monocytogenes mit der Vibralactonsonde (VLP) inkubiert. Nach Zellaufschluss wurde das erhaltene Proteom über "ClickChemie" (CC) [20][21][22] mit Rhodaminazid behandelt, und die markierten Ziele der Sonde wurden auf einem Fluoreszenzgel (SDS-PAGE) visualisiert (Abbildung 1 der Hintergrundinformationen). Zwei stark fluoreszierende, gleich intensive Banden etwa 20 kDa schwerer Proteine konnten in L. welshimeri sowie auch in L. monocytogenes (Abbildung 2 A) bis zu einer VLP-Konzentration von 3.4 mm (Abbildung 1 C der...
