Objetivo: Determinar la frecuencia de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) en Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae y la frecuencia de CTX-M en las productoras de BLEE en el Instituto Nacional de Salud del Niño - Breña (INSN-B). Material y métodos: Se analizaron enterobacterias productoras de BLEE del INSN-B entre los meses de agosto de 2012 y enero del 2013. Se incluyeron 724 aislamientos de Escherichia coli y 181 aislamientos de Klebsiella pneumoniae, consecutivos no repetidos, de pacientes hospitalizados y de la comunidad. La identificación se realizó por bioquímica convencional. la detección fenotípica de BLEE se hizo por el método de Jarlier y la detección genotípica de CTX-M mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Resultados: 281 (31%) de los aislamientos de ambas enterobacterias fueron productoras de BLEE; 207/724 (28,6%) E. coli y 74/181 (40,9%) K. pneumoniae. Se detectó el gen blaCTX-M en 256 de los aislamientos productores de BLEE (91,1%). Conclusiones: Las BLEE de tipo CTX-M están presentes en nuestra institución, a pesar que nuestros datos representan una sola institución, brinda parte del panorama nacional sobre la resistencia a los antimicrobianos; por lo tanto, el enfoque de epidemiológico molecular es importante para desarrollar más y mejores estrategias de control y manejo de estos patógenos en nuestro país.