Biji keben (Barringtonia asiatica L. Kurz) merupakan salah satu bagian tumbuhan obat yang secara empiris dimanfaatkan oleh masyarakat Tomini sebagai obat infeksi mata. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri fraksi biji keben dengan menggunakan metode difusi agar teknik sumuran serta melakukan identifikasi senyawa antibakteri dari fraksi yang memiliki aktivitas antibakteri tertinggi dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)-bioautografi dan pereaksi warna. Hasil dari pengujian aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa fraksi n-heksana, etil asetat dan air dari biji keben memiliki aktivitas antibakteri dengan diameter hambat tertinggi pada fraksi etil asetat yaitu 21,08±0,72 (mm±SD) pada bakteri Staphylococcus aureus dan 21,53±1,00 (mm±SD) pada bakteri Escherichia coli. Hasil dari KLT-bioautografi fraksi etil asetat terhadap Staphylococcus aureus memberikan dugaan bahwa senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri adalah steroid (Rf 0,75 dan 0,78) dan senyawa terpenoid (Rf 0,3) pada bakteri Escherichia coli. Berdasarkan hasil tersebut fraksi etil asetat biji keben dapat dipertimbangkan sebagai sumber antibakteri bahan alam