Evaluación de métodos de marcación-radioactivos y no radioactivos empleados en la elaboración de sondas diagnósticas de malaria

Abstract

Se probaron métodos de marcación radioactivos dentro de los cuales el sistema Random Primers resultó mejor que el de Nick Translation. Se obtuvieron sondas con mayor actividad especifica (1-2X1O9dpmIug) y una sensibilidad 10 veces mayor en la detección de ADN de Plasmodium falciparum. La sensibilidad alcanzada (12pg) obtenida con la sonda PFCOL692 desarrollada y caracterizada en nuestro laboratorio, fue igual a la obtenida con la sonda pRepHind, una de las más utilizadas en los laboratorios de otros paises. El método de marcación no radioactivoconfotobiotina mostróventajassobrela marcación porNickTranslation con nucleótidos biotinilados y se alcanzó una sensibilidad de 135 pg de ADN de P. falciparum.También se probóunsistema degeneración deseñalesfluorescentes mediante el empleo de proteasas, y los resultados preliminares muestran sus posibilidades como método de detección.KEYWORDS: Probes, nick translation, random primers, biotin, photobiotin, enterokinase, P. falciparum, P. vivax. INTRODUCCIONComo sondas se han utilizado secuencias repetitivas que tienen un alto número de copias El diagnóstico eficiente y rápido es el primer por genoma (6). una de estas deno. paso importante en el control epidemiológico de minadaDReDHind, re~ortada ~o r Franzen (7). se . , la malaria (1). Este diagnóstico generalmente se ha usadoen varios en'sayos (*.12) y ha res;ljado hace mediante la identificación microscópica de de gran utilidad en de hibridización para parásitos en sangre. El examen microscópico detectar p. falciparum, ~~~b i é~, se emplean tiene limitaciones que se hacen más evidentes sondas que detectan A R N~ (13.75), que es el en estudios de tipo epidemiológico, que requie-, ás abundante de los constituyentes de los ren el examen de gran cantidad de m uestr as. ácidos nucleicos en organismos no virales, sienPara superar esta condición, se han sugerido d o un buen blanco para diagnóstico (16). varias alternativas (2-4), dentro de las cuales está el diseno de sondas, que hacen posible Teniendo en cuenta que cada vez más se detectar el ADN del parásito mediante procedi-sugiere la necesidad de utilizar sondas para mientos de hibridización molecular. El método de diagnóstico, en este trabajo se evaluaron méto-marcación de estas sondas dependerá de los dos de marcación radioactivos y no radiactivos, niveles de sensibilidad y especificidad que se empleados en la producción de sondas para requieran en el estudio (5).diagnóstico anivel epidemiológicode P. falciparum

Ubicación de la secuencia repetitiva PFCOL692 en fragmentos genómicos de Plasmodíum falciparum

“…Sin embargo, el patrón para cepas colombianas provenientes de la misma región es muy similar y es dificil distinguirlas. Adicionalmente, esta secuencia presentó una alta sensibilidad al amplificar por PCR ADN de diferentes cepas de P. falciparum; se detectaron hasta 0,02 pg deADN, que equivalen a un parásito (19,26). Este resultado le otorga potencial como una herramienta útil en el diagnóstico de malaria.…”