Human milk is considered the ideal and most complete food for the neonate, due to its balanced nutritional composition, which contributes to the full physical and neurological development of the infant. The lipids present in human milk are sources of saturated, monounsaturated and polyunsaturated fatty acids. The polyunsaturated fatty acids of the omega-6 series, such as linoleic acid and omega-3 series, such as α-linolenic acid, are essential and are also precursors of long-chain polyunsaturated fatty acids, such as arachidonic acid, eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid, which are involved in a number of functions, such as the development of the nervous system during childhood and the increase in the intelligence quotient of the infant. Due to the lipid importance of human milk, the aim of this review article was to present the analytical methods that are currently being employed to determine its lipid composition. There are few scientific advances in lipid extraction methods and to date, most studies have evaluated the composition of fatty acids by gas chromatography. Liquid chromatography and mass spectrometry have been widely used to identify and quantify different classes of lipids of human milk. O leite humano é considerado o alimento ideal e mais completo para o neonato, devido à sua composição nutricional equilibrada, contribuindo para o pleno desenvolvimento físico e neurológico do lactente. Os lipídios presentes no leite humano são fontes de ácidos graxos saturados, monoinsaturados e poliinsaturados. Os ácidos graxos poli-insaturados da série ômega-6, como o ácido linoleico e da série ômega-3, como o α-linolênico, são essenciais e também são precursores de ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa, como o ácido araquidônico, ácido eicosapentaenoico e ácido docosahexaenoico, que estão envolvidos no desenvolvimento do sistema nervoso e no aumento do quociente de inteligência do lactente. Devido à importância lipídica do leite humano, o objetivo deste artigo de revisão foi apresentar os métodos analíticos que têm sido atualmente mais empregados para determinar sua composição lipídica. Há poucos avanços científicos quanto aos métodos de extração lipídica e até o presente momento, grande parte dos estudos avaliaram, a composição em ácidos graxos, a partir de cromatografia em fase gasosa. A cromatografia líquida e a espectrometria de massas têm sido utilizadas para identificação e quantificação de distintas classes lipídicas presentes no leite humano.