Functional Human α7 Nicotinic Acetylcholine Receptor (nAChR) Generated from Escherichia coli

Abstract

Human Cys-loop receptors are important therapeutic targets. High-resolution structures are essential for rational drug design, but only a few are available due to difficulties in obtaining sufficient quantities of protein suitable for structural studies. Although expression of proteins in E. coli offers advantages of high yield, low cost, and fast turnover, this approach has not been thoroughly explored for full-length human Cys-loop receptors because of the conventional wisdom that E. coli lacks the specific chaperones and post-translational modifications potentially required for expression of human Cys-loop receptors. Here we report the successful production of full-length wild type human ␣7nAChR from E. coli. Chemically induced chaperones promote high expression levels of well-folded proteins. The choice of detergents, lipids, and ligands during purification determines the final protein quality. The purified ␣7nAChR not only forms pentamers as imaged by negativestain electron microscopy, but also retains pharmacological characteristics of native ␣7nAChR, including binding to bungarotoxin and positive allosteric modulators specific to ␣7nAChR. Moreover, the purified ␣7nAChR injected into Xenopus oocytes can be activated by acetylcholine, choline, and nicotine, inhibited by the channel blockers QX-222 and phencyclidine, and potentiated by the ␣7nAChR specific modulators PNU-120596 and TQS. The successful generation of functional human ␣7nAChR from E. coli opens a new avenue for producing mammalian Cys-loop receptors to facilitate structure-based rational drug design.Human Cys-loop receptors are promising therapeutic targets for various neurological disorders and diseases (1-4). Structure-based drug design for these receptors requires their high-resolution structures (5). Although Cys-loop receptors contain only four major receptor types, including nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs), 2 serotonin 5-HT3 receptors, glycine receptors, and GABA A receptors, each receptor type often has multiple subtypes that form numerous functional distinct receptors. Among the human Cys-loop receptors, highresolution structures have been obtained for only the ␤3 GABA A and ␣3 glycine receptors (6, 7). Structures for other eukaryotic Cys-loop receptors include the mouse serotonin 5-HT3A receptor (8), the zebrafish ␣1 glycine receptor (9), the Caenorhabditis elegans GluCl (10, 11) and the muscle-type nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) from Torpedo marmorota (12). The dichotomy between the small number of available structures and the relatively large receptor population in the superfamily indicates the technical difficulties for structural determination of these receptors. One of the greatest challenges for structural determination of Cys-loop receptors and similarly complex human membrane proteins is the production of a large quantity of well-folded functional proteins.The ␣7 nAChR (␣7nAChR) is one of the most abundant nAChR subtypes found in the brain (13,14). It is also expressed in a wide variety of non-neuronal tiss...

X-Ray Crystallographic Studies for Revealing Binding Sites of General Anesthetics in Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

“…The lower cost, shorter timeline and versatile strains make E. coli an attractive candidate for protein expression, not only for prokaryotic proteins, but also for eukaryotic membrane proteins. Recently, we have successfully produced full-length wild type human α7nAChR using E. coli and demonstrated that the purified α7nAChR retains functionality and pharmacological properties of native α7nAChR (Tillman et al, 2016). The success with α7nAChR paves a new path for the production of eukaryotic pLGICs using E. coli .…”

“…Most studies have performed functional measurements in Xenopus oocytes or HEK cells heterologously expressing the pLGIC constructs (Bocquet et al, 2007; Du et al, 2015; Hibbs & Gouaux, 2011; Hilf & Dutzler, 2009; Huang et al, 2015; Miller & Aricescu, 2014; Morales-Perez et al, 2016). The purified pLGIC can also be directly tested for channel function, either directly measuring function of reconstituted pLGICs in the lipid bilayer (Hilf & Dutzler, 2008) or by injecting vesicles containing purified pLGICs into Xenopus oocytes for functional measurements (Labriola et al, 2013; Tillman et al, 2016). …”

Σχεδιασμός, Έκφραση Και Δομικές Μελέτες Τμημάτων Του Ανθρώπινου Νευρωνικού Νικοτινικού Υποδοχέα Ακετυλοχολίνης

“…Τα συστήματα αυτά έχουν χρησιμοποιηθεί για την υπερέκφραση περιοχών ή κολοβών κατασκευών άλλων υποδοχέων Cys-θηλιάς ή/και άλλων υπομονάδων του νικοτινικού υποδοχέα. Συγκεκριμένα, το Rosetta 2(DE3) έχει χρησιμοποιηθεί για την έκφραση της ολόκληρης, αγρίου τύπου α7 υπομονάδας του ανθρώπου (Tillman et al 2016, Elberson et al 2017, η P. pastoris για την έκφραση εξωκυττάριων περιοχών άλλων υπομονάδων του νικοτινικού υποδοχέα (Zouridakis et al 2009, Stergiou et al 2011, Kouvatsos et al 2016) και τα κύτταρα Sf9 για την παραγωγή άλλων υποδοχέων Cys-θηλιάς, όπως του GluClαR (Hibbs and Gouaux 2011), του υποδοχέα 5ΗΤ3Α επίμυος (Basak et al 2018), του β3 GABAAR και του α7 nAChR (Radner et al 2012), αλλά και κολοβών μορφών του α4β2 nAChR (Kouvatsos et al 2014).…”

“…Ο α7 ή ο α4β2 nAChR μπορεί να εκφραστεί σε βακτήρια (Tillman et al 2016), κυτταρικές σειρές εντόμων (Radner et al 2012) ή θηλαστικών (Gu et al 2016, Morales-Perez et al 2016a, Matta et al 2017, ενώ κολοβές (truncated) κατασκευές των υπομονάδων τους, στις οποίες έχει αποκοπεί μεγάλο τμήμα της κυτταροπλασματικής τους περιοχής, έχουν βελτιωμένα χαρακτηριστικά έκφρασης σε σχέση με τις ολόκληρες (Kracun et al 2008, Valor et al 2002, Kouvatsos et al 2014, Morales-Perez et al 2016a. Αντίστοιχες μελέτες δεν είχαν γίνει για τους α9*nAChRs, ενώ οι πληροφορίες που παρέχονται από την βιβλιογραφία, σχετικά με την ετερόλογη έκφραση της α9 υπομονάδας, είναι εξαιρετικά περιορισμένες (Elgoyhen et al 2001, Verbitsky et al 2000, Filchakova and McIntosh 2013.…”

“…Τέτοιοι παράγοντες είναι συνήθως φυσικοί συμπαράγοντες ή προσδέτες της πρωτεΐνηςστόχου ή αντισώματα μονής αλυσίδας που αναφέρονται ως νανοσώματα (nanobodies), που σταθεροποιούν την πρωτεΐνη και αυξάνουν την πιθανότητα κρυστάλλωσης της. Οι πρόσφατες επιτυχίες σε άλλους υποδοχείς Cys-θηλιάς είναι ενθαρρυντικές και μπορούν να αποτελέσουν πηγή έμπνευσης (Dostalova et al 2010, Hibbs and Gouaux 2011, Hassaine et al 2013, Goehring et al 2014, Hassaine et al 2014, Morales-Perez et al 2016a, Morales-Perez et al 2016b, Tillman et al 2016, Hassaïne et al 2017. Παρόμοιες μεθοδολογίες μπορούν να εφαρμοστούν και στην περίπτωση της α9Μ.…”