Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh medium dan waktu inkubasi pada sexing semen terhadap kualitas spermatozoa kambing Boer. Proses sexing menggunakan metode perbedaan densitas dengan menggunakan medium bovine serum albumin (BSA) dan SpermGrad (SG). Penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan enam perlakuan yaitu, BSA 40 menit (P1), BSA 50 menit (P2), BSA 60 menit (P3), SG 40 Menit (P4), SG 50 (P5) dan SG 60 menit (P6). Variabel yang diamati adalah kualitas spermatozoa (motilitas dan abnormalitas). Data dianalisis menggunakan analisis ragam diikuti uji lanjut berganda Duncan. Materi yang digunakan adalah semen kambing Boer. Hasil penelitian menunjukkan motilitas tertinggi terdapat pada fraksi atas (sperma X) dan fraksi bawah (sperma Y) terdapat pada perlakuan P1 (72,0 ±2,7% dan 72,0±2,7%) dan motilitas terendah pada perlakuan P6 (57,0±5,7% dan 58,0±5,7%). Persentase viabilitas sperma tertinggi fraksi atas terdapat pada P2 dan fraksi bawah P3 (74,4±1,9% dan 79,5±2,8%), yang terendah fraksi atas P1 dan fraksi bawah P6 (72,4±3,6% dan 74,1±3,2%). Selain itu, persentase abnormalitas sperma tertinggi pada fraksi atas pada perlakuan P1 dan fraksi bawah pada P6 (8,5±0,9% dan 5,4±1,2%). Hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa tidak terdapat perbedaan yang nyata motilitas antara kedua medium, dan waktu inkubasi 50 menit optimum untuk mempertahankan kualitas semen.