Isolationsbedingungen für Zellkerne aus Hefeprotoplasten

Abstract

The structure of isolated nuclei from Saccharomyces fragilis protoplasts depends on the composition of the medium used for isolation. Buffered solutions of polymers as for instance Dextran, Ficoll and Polyvinylpyrrolidon a t p H 5.5-6.5 are suitable both for carefully lysing the protoplasts and for the isolation of the nuclei. The structure of isolated nuclei does not differ markedly from nuclei in living cells. Isolated nuclei do not, behave like osmometers but are swelling in buffered solution of sugars such as sucrose, mannitol and sorbitol. uber die Isolation von Zellkernen aus Hefeprotoplasten ist bisher nur von ROZIJN u. TONINO (1964) berichtet worden. Diese Zellkerne von Saecharomyces earlsbergensis wurden auf Grund von licht-und elektronenmikroskopischen Untersuchungen als morphologisch intakt bezeichnet und biochemisch bearbeitet (TONINO u. ROZIJN 1966, SILLEVIS SMITT etal. 1970, MOLENAAR et al. 1970).Das in der vorliegenden Arbeit beschriebene Isolationsverfahren weicht von der Methode ah, die von ROZIJN u. TONINO (1964) vetwendet wurde. Es ermoglicht aber die Isolation von Zellkernen, die sich morphologisch nur wenig von denen in intakten Zellen unterscheiden, wie durch licht-und elektronenmikroskopische Untersuchungen festgestellt werden konnte. Material und NethodenObjekt und Kultivierung : Die Versuche wurden mit Saccharomyces fragilis H, durchgefiihrt. Die Hefezellen einer 48stundigen Bierwurze-Schragagarkultur wurden mit einem Nahrniedium nach OHNISHI et al. (1966) abgeschwemmt, in einen 500-ml-Rundstehkolben mit 150 ml des gleichen Nahrmediums ubertragen und 7-8 Std. bei 28 "C auf einem Schutteltisch M 56, K 15, 240 U/min (VEB FANAL, Bad Frankenhausen) inkubiert. J e 0.5 ml dieser Kultnr dienten zum Beimpfen weiterer Rundstehkolben. Nach 15-17stundigem Schiitteln wurden die Hefezellen, die sich dann in der exponentiellen Wachstumsphase befanden, durch Zentrifugation (2000 g, 2 min) abgetrennt und 2mal mit dest. H,O gewaschen. Priiparation der Protoplasten: Folgendes Praparationsverfahren fand in Anlehnung an Untersuchungen von ROST u. VENNER (1965). SUOMALAINEN et al. (1966) und SCHWENCRE et al. (1969) Verwendung: 3 g gewaschene Hefezellen (Feuchtgewicht) wurden in 10 ml TRIS-EDTA-Mediuml) suspendiert, 10 niin bei 30 "C geschiittelt (Reziprokschiittler, Schuttelfrequenz 130/min) und danach 2mal mit dest. H,O gewaschen. Die Hefezellen wurden anschliel3end in 40 ml Protoplasten-Praparationsmedium (PPM)3) resuspendiert und 1) TRIS-EDTA-Medium: 100 mM TRIS, 100 mM EDTA-Na,, mit KOH auf p H 8,O ein-2) PPM: Phosphat-Citratpuffer nach MCILVAINE, p H 6,O; 0,6 M (NH,),SO,; 0,02 M 2-Mer-gestellt.captoathanol.

High mobility group proteins in yeast

“…Several procedures were tested for their suitability for the isolation of yeast nuclei in good yields, morphological intactness, and reasonable purity. Though costly and time consuming, the isolation procedure based upon osmotic shock of yeast spheroplasts in the presence of Ficoll (12,25) was chosen as the most satisfactory in these respects. The yield of nuclei was about 30-40%.…”

“…Nuclei were prepared from the spheroplasts by the following method (12,25). All of the operations were performed at 0-40C.…”

The organization of oligonucleosomes in yeast

“…The isolation protocol incorporated elements of the methods of May, and of Bhargava and Halvorson as modified by Sajdel-Sulkowska et al (16)(17)(18). All steps were on ice or at 40; centrifugation steps were in a Sorvall HB-4 swinging bucket rotor.…”