Bakteri proteolitik merupakan bakteri yang mampu menghidrolisis protein menjadi asam amino yang lebih sederhana. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan aktivitas proteolitik dan enzim protease dari isolat bakteri yang diisolasi dan dikarakterisasi dari rhizosphere tanaman kedelai (Glycine max. L) di lahan pertanian Trenggalek, Jawa Timur. Penelitian ini dilakukan secara deskriptif kuantitatif. Bakteri rhizosphere diisolasi dari tanah pertanian yang ditanami kedelai di Trenggalek, Jawa Timur. Bakteri yang diperoleh diuji aktivitas proteolitik dengan menggunakan media selektif Skim Milk Agar (SMA). Bakteri yang memiliki aktivitas proteolitik ditandai dengan adanya zona bening (halo zone) yang terbentuk disekitar koloni. Uji aktivitas enzim protease dilakukan pada tiga isolat yang membentuk zona bening terbesar dengan cara menginkubasi bakteri penghasil enzim protease pada media selektif Skim Milk Broth (SMB) setiap 0, 4, 24, 48, 72 jam. Aktivitas enzim protease di ukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm. Hasil dari penelitian ini diperoleh 7 isolat bakteri yang memiliki kemampuan dalam menghasilkan aktivitas proteolitik berupa terbentuknya zona bening disekitar koloni. Ke 7 isolat tersebut di karakterisasi secara makroskopis dan mikroskopis dengan hasil gram negatif, dan berbentuk basil. Indeks proteolitik pada 3 isolat dengan zona bening terbesar diperoleh dari hasil indeks proteolitik terbesar pada isolat IRK1 sebesar 2,54; IRK4 sebesar 1,77 dan IRK7 sebesar 1,80. Aktivitas enzim protease dari ketiga isolat IRK1, IRK4, dan IRK7 secara berurutan diperoleh hasil optimum pada inkubasi 24 jam sebesar 5,97 U/mL, 5,43 U/mL, dan 4,56 U/mL.