ABSTRAK. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan kualitas oosit sapi Pesisir yang akan diproduksi secara in vitro dan untuk menentukan dosis penambahan Insulin pada media maturasi in vitro efektif untuk meningkatkan kematangan oosit sapi Pesisir. Sampel yang digunakan yaitu ovarium sapi Pesisir yang diambil di RPH kemudian dilakukan koleksi oosit dengan metode slicing di Laboratorium Bioteknologi. Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) yang terdiri dari 4 perlakuan dan 4 ulangan. Perlakuan yang digunakan adalah penambahan insulin pada media maturasi in vitro yang terdiri dari tanpa insulin (P1), insulin 10 µg/ml (P2), insulin 15 µg/ml (P3) dan insulin 20 µg/ml (P4). Oosit sapi Pesisir dimaturasi dalam media maturasi selama 24 jam di dalam inkubator CO2 dengan suhu 38,5 ᵒC. Sampel yang sudah dimaturasi diwarnai dengan 2% aceto-orcein selama 5 menit kemudian zat pewarna dihilangkan dengan campuran (asam asetat, gliserin dan aquadest) selanjutnya pengamatan inti diamati dengan menggunakan mikroskop. Hasil penelitian menunjukkan bahwa oosit yang paling banyak ditemukan adalah oosit grade B (75,59%), A(13,53%), C (8,48%), dan yang paling sedikit adalah grade D (2,40%). Penambahan Insulin dengan dosis 10 µg/ml dan 15 µg/ml pada media maturasi in vitro dapat meningkatkan pematangan oosit sapi pesisir yang mencapai metaphase II (MII) daripada tanpa insulin, sedangkan penambahan dosis insulin 20 µg/ml menurunkan pematangan oosit sapi pesisir yang mencapai MII. Berdasarkan hasil penelitian tersebut disimpulkan bahwa oosit yang dimaturasi dengan penambahan insulin 10 µg/ml dan 15 µg/ml sangat berpengaruh (P<0,01) terhadap pematangan oosit mencapai MII dan hasil terbaik adalah penambahan insulin 15 µg/ml sebesar 84,58%.