The structural stability of an expression plasmid bearing a heterologous cloned gene depends on whether this gene is expressed or not

Капралек, Ф.; Ječmen, P.

doi:10.1007/bf01022319

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“…This conclusion was supported by the observation that A3/5 displaced JeRS 325 in glucose-limited chemostat cultures with either (NH 4 ) 2 SO 4 (D ‫ס‬ 0.19 h −1 ) or NaNO 3 (D ‫ס‬ 0.13 h −1 ) as the nitrogen source. Reductions in specific growth rate for plasmid-bearing cells compared to plasmid-free cells have been observed for a variety of recombinant bacteria, particularly those expressing foreign proteins (Glick, 1995;Kaprálek and Jecmen, 1992), although reduced growth rates for fungal transformants have not previously been reported. Indeed, Withers et al (1998) found that a transformant of A. niger carrying 20 extra copies of the homologous glaA gene had no growth rate disadvantage compared to the untransformed parental strain, even under inducing conditions.…”

Section: Discussionmentioning

confidence: 94%

Evolution of a recombinant (gucoamylase‐producing) strain of Fusarium venenatum A3/5 in chemostat culture

Wiebe

Robson

Shuster

et al. 2001

Biotech & Bioengineering

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Fusarium venenatum JeRS 325 is a transformant of strain A3/5 which produces Aspergillus niger glucoamylase (GAM) under the control of a Fusarium oxysporum trypsin-like protease promoter. The evolution of JeRS 325 was studied in glucose-limited chemostat cultures grown on NaNO3 or (NH4)2SO4 as the nitrogen source. Thirteen mutants which were more highly branched and four mutants which were more sparsely branched than the parental strain were isolated from the NaNO3 chemostat. The highly branched mutants detected in this chemostat did not displace the sparsely branched population. The mutants isolated from the NaNO3 chemostat complemented representative strains previously isolated from glucose-limited chemostat cultures of F. venenatum A3/5 grown on (NH4)2SO4, but showed little complementation between themselves. By contrast, a highly branched mutant isolated from the (NH4)2SO4 chemostat culture displaced the sparsely branched mycelial population. None of the mutants isolated from the NaNO3 or (NH4)2SO4 chemostats produced as much GAM as JeRS 325. Southern blot analysis showed that all except one mutant had lost copies of both the glucoamylase and the acetamidase (the selectable marker) genes. However, specific GAM production was not necessarily correlated with the extent of glaA gene loss observed. Further, 10 of the mutants had lost the ability to grow on acetamide as the sole nitrogen source, although they retained copies of the amdS gene. In competition studies, mutants which could not utilize acetamide displaced mutants which could. The presence of foreign DNA in JeRS 325 resulted in a reduced specific growth rate (compared to A3/5), but the presence of the foreign DNA did not prevent the evolution of the strain or the isolation of mutants which had improved growth rates.

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Section: Discussionmentioning

confidence: 94%

Evolution of a recombinant (gucoamylase‐producing) strain of Fusarium venenatum A3/5 in chemostat culture

Wiebe

Robson

Shuster

et al. 2001

Biotech & Bioengineering

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“…Cloned genes must be maintained stably for productive fermentations (Kapralek and Jecmen, 1992). Plasmids are common expression vectors that may lose the cloned gene due to segregational instability (loss of the whole plasmid from the bacterium) or structural instability (mutations such as deletions, insertions, and rearrangements of the plasmid DNA) (Ensley, 1985).…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

“…The number of stable generations of growth until 90% of the cell population possessed plasmids (gengo% point) was determined by counting the hours of exponential growth during the batch growth phase at the beginning of the continuous fermentation (tfermentor bakh phase), as well as the hours of continuous feed to the reactor (&hemostat 90% plasmid-bearing): study while evaluating the effect of growth rate on plasmid stability. In addition, since the extra metabolic burden from cloned-gene expression has a significant effect on plasmid structural stability (Kapralek and Jecmen, 1992), the extent of cloned-gene expression was investigated while evaluating the hoklsok system.…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

Temperature and Growth Rate Effects on the hok/sok Killer Locus for Enhanced Plasmid Stability

Jahng

Wood

1994

Biotechnology Progress

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The hok/sok locus, isolated from the multiple-resistance plasmid R1 of Escherichia coli, is very efficient at ensuring the stable maintenance of plasmids in Gram-negative systems by killing plasmid-free cells as they arise. To investigate independently the influence of temperature and growth rate on the effectiveness of hok/sok, continuous fermentations have been conducted with the pUC-based, IPTG-induced, beta-galactosidase expression vector pTKW106. At fixed temperature (37 degrees C), decreasing the dilution rate decreased plasmid stability, and at a fixed, low dilution rate (D = 0.15/h), decreasing the temperature resulted in an increase in plasmid stability. These trends are explained by the specific beta-galactosidase activity of each continuous fermentation: higher, specific, recombinant protein expression led to decreased plasmid stability (due to either segregational or structural instability, as determined by plasmid DNA isolation). A representative fed-batch medium produced more beta-galactosidase on a volumetric basis than M9C in the chemostat, and addition of the hok/sok locus increased segregational stability by 8-22-fold in continuous fermentations that lacked antibiotic selection pressure and in which beta-galactosidase was constantly expressed a 12% of total cell protein for 60 h (43-47 generations).

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“…La estrategia de utilizar promotores fuertes y constitutivos, o por periodos prolongados desacoplados del crecimiento casi siempre resulta debilitante y, a veces letal -para el hospedador [166][167]. Los altos niveles de expresión podrían ser alcanzables a través del uso de promotores fuertes, pero regulables [153] [165] [168][169].…”

unclassified

Estudio de la expresión de angiostatina humana recombinante en cepas de <i>Escherichia coli</i>

Niosi¹

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La angiogénesis se define como el proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de otros ya pre existentes. La angiostatina es una fracción del plasminógeno de 38 KDa, que ha demostrado en estudios in vitro e in vivo poseer la capacidad de disminuir el crecimiento tumoral y la diseminación metastásica. La importancia de la angiostatina radica en que se observo que era capaz de inhibir específicamente la proliferación endotelial y, de forma colateral, el crecimiento de los tumores. Fue la primera proteína antiangiogénica endógena de origen natural descubierta bajo financiación de EntreMed (desde el 16 de junio de 2014 cambio su nombre a CASI Pharmaceuticals) en 1994 por los doctores Michael O' Reilly y Judah Folkman , investigadores del Hospital de Niños de Boston (EE.UU.). A la fecha, se han realizado una innumerable serie de estudios clínicos en vías de su empleo como biofármaco para el tratamiento de varias enfermedades como ser artritis reumatoidea, retinopatía diabética, glaucoma neovascular y el desarrollo de tumores. Esta tesis se refiere a la investigación sobre la expresión de angiostatina humana recombinante en diferentes cepas de Escherichia coli como sistema modelo de estudio. Para tal fin fueron utilizados dos sistemas de expresión. En un caso, mediante la inducción con IPTG. El mismo se trata del sistema de expresión comercial pET22b / BL21 (DE3), y su elección radica en que es uno de los sistemas de más alta difusión y ha sido extensamente utilizado para la obtención de proteínas recombinantes a mediana o gran escala. En el otro sistema de expresión elegido para la producción de angiostatina, la inducción ocurre por una limitación nutricional. La inducción se lleva a cabo mediante la limitación del fosfato inorgánico en el medio de cultivo, a través del promotor de la fosfatasa alcalina de E. coli ubicado en el plásmido de expresión. Ambas construcciones poseen características bien diferenciadas, por un lado la última mencionada, es una inducción gradual en el tiempo, con lo cual la adaptación celular al proceso sería mayor que en el caso de inducción por IPTG. Con el fin de caracterizar ambos sistemas, se estudiaron parámetros como ser el crecimiento celular, la estabilidad, la perdida y la amplificación del plásmido, la sobreproducción de proteína recombinante, el metabolismo celular, y algunas respuestas de estrés después de la inducción de la expresión en sistemas de cultivo continuo, cultivos en batch, tanto en erlenmeyers agitados como en biorreactor para pasar por último al sistema de batch alimentado limitado en fuente de carbono como en fosfato inorgánico. Como se mencionó, serán evaluadas diferentes cepas de E. coli en diferentes tipos de medios cultivo. El motivo es que en experiencias llevadas a cabo previamente, se evidenciaron comportamientos muy diferenciales con respecto a la estabilidad del plásmido recombinante y muy fundamentalmente sobre la producción de metabolitos indeseados que afectan la estabilidad del sistema de expresión como es el ácido acético, y se ha demostrado que su acumulación ejerce un efecto adverso sobre la expresión de diversas proteínas recombinantes. Otros parámetros intrínsecos de los microorganismos recombinantes serán estudiados como ser la evaluación de las velocidades máximas de crecimiento (μmáx), en algunos casos el coeficiente de mantenimiento celular (ms) con el objetivo de observar el impacto y el costo energético para crecer a una velocidad específica de crecimiento deseada tal que no se evidencie la aparición de ácidos orgánicos. Estos últimos trabajos se contrastaron con sus respectivas cepas silvestres, debido a que da una idea del estrés producido sobre el hospedador debido a la inducción de la expresión. Hay mucha bibliografía sobre los sistemas inducibles por IPTG pero prácticamente nada respecto al sistema de inducción por medio del promotor de la fosfatasa alcalina. Finalmente, podemos decir, en términos generales, que en la búsqueda de la optimización de la expresión de proteínas recombinantes, deben tenerse en cuenta características inherentes de los microorganismos hospedadores, como ser el problema técnico de la acumulación de acetato en el cultivo y la respuesta celular debida a la inducción. Estas últimas cuestiones se engloban en un concepto denominado carga metabólica donde generalmente se manifiesta consumo de sustrato no asociado al crecimiento. El interés estriba en redirigir los flujos metabólicos para incrementar productividad del proceso, y lograr la correcta expresión a altos niveles del gen clonado en el microorganismo huésped elegido. Desde el año 2005 se creó una vinculación entre el CINDEFI (Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales) y el Departamento de Cirugía, Programa de Biología Vascular Escuela de Medicina de Harvard y del Hospital de Niños de Boston, Massachusetts, (EE.UU), grupo de trabajo del doctor Folkman. Dicha institución aporto el material genético codificante para la angiostatina humana. A partir del mismo se planteó esta tesis donde se estudió la expresión de angiostatina como proteína modelo para estudiar la capacidad de producción de la misma expresada en E. coli recombinante inducible por IPTG y por la limitación de fosfato inorgánico en el medio de cultivo.

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The structural stability of an expression plasmid bearing a heterologous cloned gene depends on whether this gene is expressed or not

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Evolution of a recombinant (gucoamylase‐producing) strain of Fusarium venenatum A3/5 in chemostat culture

Evolution of a recombinant (gucoamylase‐producing) strain of Fusarium venenatum A3/5 in chemostat culture

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Estudio de la expresión de angiostatina humana recombinante en cepas de <i>Escherichia coli</i>

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