Minyak atsiri kulit jeruk nipis (Citrus aurantifolia) mempunyai efek antibakteri pada pertumbuhan Streptococcus agalactiae melalui penghancuran struktur sel bakteri. Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan kemampuan antibakteri minyak atsiri kulit jeruk nipis dalam mencegah pertumbuhan bakteri Streptococcus agalactiae secara in vitro dan mengetahui konsentrasi hambat minimum yang diperlukan. Desain penelitian yang digunakan adalah experimental post test only group menggunakan metode difusi sumuran. Tujuh konsentrasi berbeda dari minyak atsiri (0%; 3,125%; 6,25%; 12,5%; 25%; 50%; 100%) digunakan dalam penelitian ini. Zona hambat yang didapat kemudian diukur menggunakan jangka sorong. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kenaikan konsentrasi minyak atsiri kulit jeruk nipis berbanding lurus dengan bertambahnya diameter zona hambat di sekitar sumuran. Nilai konsentrasi hambat minimum (KHM) minyak atsiri kulit jeruk nipis didapat pada konsentrasi 25%. Uji korelasi Spearman menunjukkan korelasi kuat dan signifikan (r = 0,799, p = 0,000), dan uji komparasi Kruskall Wallis menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan antar rerata tiap kelompok (p = 0,000). Dari percobaan ini, bisa disimpulkan apabila minyak atsiri kulit jeruk nipis dapat mencegah pertumbuhan Streptococcus agalactiae secara in vitro pada konsentrasi 25%.