У статті наведено результати ефективності виділення ДНК вірусу АЧС при використанні трьох типів видільних наборів, які найчастіше використовуються в діагностичних лабораторіях України.Встановлено, що при використанні наборів сорбційного («ДНК-сорб-В») та преципітуючого типу («РИБО-преп») виділення ДНК відбулося в усіх 10 досліджуваних зразках в зазначених тест-системою параметрах. При використанні видільного набору колоночного типу («IndiSpin Pathogen Kit») у одному зразку із селезінки свині не пройшов контроль виділення, що могло бути спричинене занадто високими концентраціями нуклеїнових кислот. Необхідно враховувати рекомендації виробника видільного набору «IndiSpin Pathogen Kit», що передбачають зменшення кількості вихідного зразка селезінки при виділенні до 5-10 мг (використання 10% суспензії).

У статті представлені результати розробки способу диференційної діагностики африканської та класичної чуми свиней методом дуплексної зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР) у режимі реального часу. У процесі роботи підібрано три пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до цільових ділянок гену B646L вірусу АЧС, нетрансльованої ділянки 5' UTR вірусу КЧС та гену PRP(внутрішній контроль). Обрано оптимальний режим ампліфікації та визначено критерії оцінки результатів ПЛР. Розроблений діагностикум дозволяє одночасно виявляти обидва збудники (вірус АЧС та КЧС) у досліджуваній пробі, сприяючи цим економії часу, трудових ресурсів та коштів, які витрачаються на дослідження. Ключові слова: африканська чума свиней (АЧС), класична чума свиней (КЧС), ЗТ-ПЛР у режимі реального часу, праймери. * Аспірант, наук. керівник -д-р вет. наук, проф., член-кор. Ничик С.А.

The first Ukrainian real-time reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-qPCR) based test kit for the differential diagnosis of African (AFS) and Classical swine fever (CSF) has been developed in the Institute of Veterinary Medicine of NAAS. The proposed test kit allows simultaneous detection of three targets: ASFV DNA, CSFV cDNA and an internal control sample. The goal of this work was to provide an expert evaluation of the RT-qPCR kit for differential diagnosis of ASF and CSF according to appearance, analytical sensitivity, specificity and repeatability. Interdepartmental evaluation of the kit was conducted in the State Scientific and Research Institute of Laboratory Diagnostics and Veterinary and Sanitary Expertise (DNDILDEVSE) in accordance with the approved methodology. The RT-qPCR kit sensitivity was determined by testing 10-fold serial dilutions of the ASFV DNA and CSFV cDNA (concentration range was 103–100 copies/μl). For specificity determination reference samples of ASFV DNA different genotypes, ASF and CSF positive and negative field samples, as well as pathogens which cause similar to ASF and CSF clinical syndromes were used. Sample preparation and amplification were performed according to the test kit instructions. The amplification was accomplished on QuantStudio™ 5 System (Applied Biosystems). As a result of accomplished interdepartmental evaluation high sensitivity, specificity and repeatability of RT-qPCR kit were confirmed. In particular, it was determined that the limit of detection of the RT-qPCR kit was 5 copies of the ASFV and CSFV genomes per one reaction. The high specificity of the assay to ASFV (I, II, V, VIII, IX and X genotypes) and CSFV was confirmed. It was showп no cross-reactions with closely related pigs viruses (porcine circovirus type 2, porcine reproductive and respiratory syndrome virus and virus of Aujeszky's disease). The high enough repeatability of results was also confirmed. In conclusion, the obtained results are in compliance with the requirements of the RT-qPCR kit normative and technical documentation. This RT-qPCR kit will be recommended for use in veterinary medicine laboratories after its registration would be done.

Інститут ветеринарної медицини НААН КОНСТРУЮВАННЯ ТА АПРОБАЦІЯ ПРАЙМЕРІВ ДЛЯ ДЕТЕКЦІЇ ВІРУСУ НОДУЛЯРНОГО ДЕРМАТИТУ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ МЕТОДОМ ПЛР У РЕАЛЬНОМУ ЧАСІ Здійснено конструювання праймерів та флуоресцентного зонду для детекції вірусу нодулярного дерматиту методом полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі (ПЛР-РЧ). Запропоновані праймери дають можливість детектувати всіх представників роду Capripoxvirus. Проведено порівняльні дослідження комерційної ПЛР-суміші qScript™ XLT (Quanta) та самостійно приготовленої ПЛР-суміші, в результаті чого отримані однакові результати параметрів ампліфікації, що дозволяє зменшити собівартість дослідження. Проведена апробація запропонованих праймерів на 32 зразках ДНК, отриманих за експериментального зараження великої рогатої худоби вірусом Lumpy skin disease virus та вірусом віспи кіз. Ключові слова: нодулярний дерматит, ВРХ, ПЛР-РЧ, праймери. DEVELOPMENT AND APPROBATION OF PRIMERS FOR IDENTIFICATION OF LUMPY SKIN DESEASE VIRUS BY qPCR METHODIntroduction. Lumpy Skin Disease (LSD) is a highly contagious transboundary viral disease of cattle characterized by the formation of necrotizing skin nodules. The OIE requires notification of this disease due to significant economic losses during the outbreak. As the numbers of LSD outbreaks are increasing in the world, including Russia that shares borders with Ukraine, a threat of pathogen introduction into the country is high.The goal of the work was to design primers and a fluorescence probe for LSD virus detection and their approbation with qPCR method.Materials and methods. The specific primers and a fluorescence probe to the part of the viral genome which encoding the core DNA binding phosphoprotein (GenBank: KH 764645) were selected. The developed primers provided amplification of the viral genome fragment with length 151 bp. The Capripoxvirus DNA samples, provided by Dr. Hoffman (FLI, Germany) were used for approbation of developed primers. Both in-house PCR-mix (Thermo Fisher Scientific reagents) and commercial qScript™ XLT (Quanta) were used. Amplification was conducted using Roto-Gene Q.Results of research and discussion. It was confirmed that all Capripoxvirus agents could be detected using the developed primers. The study shown that the results obtained using the in-house PCR-mix were similar to the commercial qScript™ XLT (Quanta). Using the in-house PCR-mix potentially can reduce the test's cost. It was confirmed 100% specificity and high sensitivity of the developed primers on 18 LSD virus and 14 goat poxvirus DNA samples obtained from experimentally infected cows and goats.Conclusions and prospects for further research. The developed primers can be recommended to use in the veterinary medicine labs for diagnosis of both LSD virus and other Capripoxvirus after the appropriate validation will be done.

1 Інститут ветеринарної медицини НААН 2 Білоцерківський національний аграрний університет 3 Національна академія аграрних наук України РОЗРОБКА ТА ВАЛІДАЦІЯ ПОЛІМЕРАЗНОЇ ЛАНЦЮГОВОЇ РЕАКЦІЇ У РЕЖИМІ РЕАЛЬНОГО ЧАСУ ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ ДНК ПАТОГЕННИХ ЛЕПТОСПІР У статті наведені результати розробки та валідації методики полімеразної ланцюгової реакції у режимі реального часу для детекції ДНК патогенних лептоспір за міжнародними вимогами. Встановлено, що розроблена праймерна система проявляє виражену гібридизаційну активність по відношенню до ДНК-матриці при 45ºС з концентрацією іонів магнію у реакційній суміші 1,5 мМ/мкл. Представлені показники визначення чутливості, межі виявлення та специфічності методики, які свідчать про можливість її застосування з метою виявлення ДНК патогенних лептоспір при діагностиці лептоспірозу в господарствах України. Ключові слова: лептоспіра, ДНК, ПЛР у режимі реального часу, протокол ампліфікації, оптимізація.Вступ. Лептоспіроз це один з найпоширеніших у всьому світі антропозоонозів, у природних умовах частіше хворіють свині та велика рогата худоба, сприйнятливі також коні, вівці, кози, буйволи, лисиці, норки, песці, птиця, собаки, білі миші, комахоїдні, хижаки і сумчасті. За своєю актуальністю, епізоотологічним значенням він знаходиться поряд з туберкульозом та бруцельозом, а за кількістю відомих сероварів лептоспіри поступаються лише ентеробактеріям [1,2]. У світі спостерігається щонайменше 0,5 млн. випадків захворювання людей в рік, а рівень смертності від лептоспірозу у людей коливається від 5% до 15% [3]. збудником хвороби є спірохети, котрі виділені в самостійне сімейство Leptospiraceae, порядку Spirochaetalis, в який включений рід Leptospira, об'єднуючий два види лептоспір: L. interrogans (патогенні лептоспіри) та L. biflexa (лептоспіри-сапрофіти).В останній час проводяться активні досліди з розробки і використання ПЛР з метою визначення генетичних та патологічних характеристик лептоспір та діагностики лептоспірозу [4].