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Devido às aparições cada vez mais frequentes de animais selvagens em regiões rurais e urbanas, gerando um alerta na população, na saúde pública e no ramo econômico, o presente trabalho teve como objetivo a clonagem, sequenciamento, expressão e purificação dos genes do GDF9 e BMP15 de bovinos com o intuito de desenvolver uma medida efetiva de controle populacional das capivaras do DF. Esses fatores atuam na função ovariana de muitos mamíferos, incluso a capivara, e por meio da incorporação dessas proteínas recombinantes bovinas à bactérias da espécie Escherichia coli está em andamento o desenvolvimento de uma vacina capaz de executar uma reação cruzada no sistema imunológico das capivaras. Essa reação desencadeia a produção de antígenos contra a BMP15 e o GDF9 do próprio organismo, proporcionando um bloqueio na maturação dos ovócitos da capivara e assim resultando em uma forma de contracepção ou esterelização imunológica. Para elaboração da vacina, primeiramente foi realizada a superexpressão das proteínas desejadas em bactérias E. coli no laboratório. Em seguida, algumas modificações no genoma das bactérias foram feitas para incluir as sequências proteicas de GDF9 e BMP15 e para torná-las mais resistentes a alguns antibioticos, dessa forma, promovendo a melhor expressão das proteínas. Com a sequência protéica já incorporada ao DNA destas, houve então um processo de transformação das bactérias por intermédio de etapas até a completa produção das proteínas. As primeiras etapas se voltavam para a inoculação de bactérias dentro de um meio e para a indução da produção de proteínas. Depois disso, realizava-se a disjunção das proteínas desejadas das demais estruturas presentes nas bactérias por meio da sonicação, e posterior a ela vinha a centrifugação, na qual se dava continuidade ao processo de separação da proteína na solução do restante das estruturas bacterianas, que ficam em forma de pellet. Em seguida, era efetuada a purificação, etapa que utiliza cromatografia de afinidade e que dá origem à proteína pura. Então, era desempenhado um processo de quantificação, onde a proteína já expressa, purificada e pronta para ser injetada era avaliada na forma de géis que apresentavam a quantidade de proteínas obtidas e confirmavam se elas eram verdadeiramente as proteínas de interesse. Por fim, era avaliada a regulação da concentração do produto final obtido, pois como se faz necessária uma superestimulação no organismo animal, a concentração de proteínas também precisava ser alta. Uma vez que as etapas de produção das proteínas são finalizadas, é adicionado um adjuvante para que a vacina seja aplicada, porém o trabalho não pode avançar até o estágio de imunização das fêmeas por conta da paralisação decorrente da pandemia e de problemas na conclusão do terceiro plano de ação. Pode-se concluir que o manejo de animais silvestres apresenta grandes desafios e com o avanço populacional desordenado faz-se ainda mais necessário buscar soluções para o controle das taxas de fertilidade das capivaras por meio de uma alternativa não invasiva, com um custo benefício vantajoso e de execução viável.

Melanoma is classically described as one of the tumors that has high radioresistance in both in vitro and clinical studies. Nitric oxide is a molecule that performs various functions in the body and interacts with pathways that can alter the tumor microenvironment, including radioresistance. The present study aims to evaluate the role of nitric oxide (NO) as a radiomodifier in the human melanoma cell line, SK-MEL-37, in gamma irradiated cultures (60Co) at doses between 0.5 and 16 Gy. Cultures received prior treatments with L-NAME (N (ω)-nitro-L-arginine methyl ester) a nitric oxide synthase inhibitor (NOS) or sodium nitroprusside (NPS), a nitrogen donor. The micronucleus frequency assay showed that the 500 µM NPS concentration made the cells more sensitive to the effects of ionizing radiation and maintained the cell cycle rate without significant changes up to the 8 Gy. Treatment with 60 µM NPS protected cell culture probably by reducing cell cycle speed, although inducing greater genotoxic damage. The inhibition of ON caused by the concentration 6.4 µM L-NAME made the cell culture more radiant resistant reflecting in a lower frequency of genotoxic damage. The data obtained showed that increasing or decreasing nitric oxide concentration in in vitro cultures of SK-MEL-37 may confer radioresistance or sensitivity by different mechanisms.

Micronucleus assay is a test used to evaluate genotoxic damage in cells, which can be caused by various factors, like ionizing radiation. Interactions between radiation energies and DNA can cause breakage, leading to use chromosomal mutations or loss of genetic material, important events that could be induced in solid tumors to mitigate its expansion within human body.  Melanoma has been described as a tumor with increased radio resistance.  This work evaluated micronuclei percentages (%MN) in human melanoma cells (SK-MEL-37), irradiated by gamma radiation, with doses between 0 and 16Gy.  Cell suspensions were irradiated in PBS by a 60Co source in doses between 0 and 16Gy, and incubated by 48h.  Then cell membranes were lysed in the presence of SYTOX Green and EMA dyes, preserving nuclear membranes.  Using this method, EMA-stained nuclei could be discriminated as those derived from dead cells, and SYTOX nuclei and micronuclei could be quantified.  Micronuclei percentages were found to be proportional to dose, (R2 = 0.997).  Only the highest dose (16Gy) could induce statistically significant increase of MN (p<0.0001), although cultures irradiated by 4, 8 and 16Gy showed significant increase of dead cell fractions.  Calculation of the nuclei-to-beads ratio showed that 8 and 16Gy could reduce melanoma cell proliferation.  Results showed that although cell death and loss of proliferative capacity could be observed on cultures irradiated at lower doses, genotoxic damage could be induced only on a higher dose. Resistance to radiation-induced genotoxicity could explain a relatively high radio resistance of melanoma tumors.

The micronucleus assay is an important technique used to evaluate genotoxic damage of chemical or physical agents (as ionizing radiations) on cells, based on quantification of cells bearing micronuclei, which are fragments derived from damage (breakage) of the DNA. Currently, this technique was updated to an automated approach that relies on plasma membrane dissolution to analyze fluorescent dye-labelled nuclei and micronuclei by flow cytometry. Cell suspensions were irradiated in PBS by a 60Co source in doses between 0 and 16 Gy, and incubated by 72h. Cell membranes were lysed in the presence of SYTOX Green and EMA dyes, so EMA-stained nuclei could be discriminated as from dead cells, and nuclei and micronuclei could be quantified. Amounts of micronuclei (percent of events) in the samples, were found to be proportional to radiation doses, and could be fitted to a linear-quadratic model (R² = 0.993). Only higher doses (8 and 16 Gy) and positive control could induce relevant increases in micronucleus amounts. The incorporation EMA showed an increase in irradiated cells. Mid- to high doses (4, 8 and 16 Gy) induced reduction of cell proliferation. Experiments showed the suitability of the technique to replace traditional microscopy analysis in evaluation of the effects of ionizing radiations on cells, with possibility to use in biological dosimetry.