Tuberkulosis paru adalah salah satu penyakit infeksi menular yang menyerang saluran pernapasan bawah yang disebabkan oleh bakteri patogen yaitu Mycobacterium tuberculosis. Kesulitan dalam penanganan tuberkulosis salah satunya disebabkan oleh terjadinya resistensi antibiotik rifampisin sebagai antibiotik lini pertama. Resistensi rifampisin dikendalikan oleh gen rpoB (RNA Polymerase β-Subunit) pada Mycobacterium tuberkulosis yang akan terekspresi ketika terjadi mutasi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui mutasi gen rpoB pada penderita tuberkulosis paru di BBKPM Makassar. Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif dengan desain cross sectional menggunakan 20 sampel sputum positif tuberkulosis yang telah melakukan terapi antibiotik lini pertama selama dua bulan. Deteksi mutasi gen rpoB dengan metode PCR dan dilanjutkan dengan sekuensing. Hasil dari penelitian yaitu didapatkan mutasi gen rpoB pada 17 sampel, yang terjadi pada posisi 1304 bp, 1322 bp, 1333 bp, 1348 bp, 1349 bp dan 1471 bp. Kesimpulan dari penelitian ini yaitu terjadinya mutasi gen rpoB resisten terhadap antibiotik rifampisin.