Although colony-forming unit (CFU) counting is widely used to quantify fungal load in tissue from animal experimentally infected with Paracoccidioides brasiliensis, several technical disadvantages have been described. Here we developed highly accurate quantitative PCR (qPCR) assays to determine the relative P brasiliensis load in lungs from infected mice. SYBR Green- and TaqMan-based assays using primers and probe for the 43-kDa glycoprotein (gp43) gene detected as little as 270 gene copies (about 2 fg of DNA) per reaction. Although qPCR assays cannot distinguish between living and dead yeasts, we found a highly positive linear correlation between CFU and qPCR.

Às agências de fomento CAPES e FAPESP pelo apoio financeiro ao projeto. Aos professores Dr. Roberto Martinez (FMRP-USP) e Dr. João Santana da Silva (FMRP-USP), que gentilmente cederam as cepas de P. brasiliensis utilizadas no presente estudo.Aos alunos e técnicos do laboratório de genômica e imunobiologia (EERP-USP) e também do laboratório de inflamação e dor (FMRP-USP), pelo suporte de materiais.Aos alunos e técnicos do laboratório de Imunoquímica e Glicobiologia por todo auxílio e materiais cedidos. Em especial à técnica Sandra pelo suporte e toda amabilidade com que sempre nos tratou.À Porf.a Dr.a Maria Eugenia Guazzaroni e á todos os alunos do laboratório de metagenômica funcional (FFCLRP-USP) pelo imensurável apoio ao projeto por cederem gentilmente equipamentos e materiais necessários.À técnica e amiga Thalita Aparecida Riul Prado que sempre atendeu com prontidão a todas as minhas solicitações e urgências. Obrigada pela amizade, boas conversas e por toda gentileza que trata a todos.Ao meu querido orientador, Prof. Dr. Ademilson Panunto Castelo minha eterna gratidão pela excelente orientação, paciência, humildade e dedicação em cada etapa do projeto desenvolvido e também minha admiração por tudo o que ensina como professor, pesquisador e ser humano. Muito obrigada por ter sido sempre gentil.A toda equipe que em algum momento fez parte do nosso laboratório, pelos ensinamentos por me ensinarem todas as técnicas e métodos disponíveis. Em especial ao Dr. Fabrício Freitas Fernandes, que contribuiu para que esse trabalho acontecesse.Às minhas amigas biólogas e companheiras de pós-graduação Amanda, Giovana e Franciene pelas infinitas risadas, pelos abraços, almoços e apoio.Aos meus amigos imunologistas, companheiros de programa, Alexander, Djulio Elidiane, João, Stela e Valter, não tenho como agradecer todo apoio emocional que recebi de vocês. Obrigada por todo encorajamento, por tudo o que aprendemos juntos em sala de aula e fora dela.À minha família espiritual, Igreja de Cristo internacional de Ribeirão Preto, que me acolheu no momento que eu mais precisei, perseverando em oração pela minha vida e para que esse trabalho acontecesse. Amo cada um de forma especial.À minha amiga Valéria, que dividiu não só o "teto" como os melhores e piores momentos. Obrigada pelas conversas e risadas.Às minhas amigas na fé Pamela e Ana que suportaram com paciência e amor minhas dúvidas e questionamentos. Sem vocês não chegaria tão longe.À minha amiga Paula pelas incontáveis conversas, pelo apoio emocional, espiritual e pelo encorajamento diário.Ao meu melhor amigo e namorado Caio, obrigada por ter sido tão presente nessa jornada, me ouvindo e se esforçando para compreender cada etapa. Com você sou melhor a cada dia, profissionalmente e espiritualmente, te amo.À toda minha família, pelo apoio, interesse e respeito ao meu trabalho. Principalmente aos meus tios Moisés e Elen, pelo acolhimento, servidão e por sempre estarem presentes. Ao meu tio Daniel, pelo respeito, paciência e sabedoria. Às minhas tias paternas, Cris, por sempre me ...

Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by fungi of the Paracoccidioides genus, being endemic in Latin America and with the highest number of cases in Brazil. Paracoccidioides spp. release a wide range of molecules, such as enzymes, which may be important for PCM establishment. Here, we identified the 85- and 90-kDa proteins from the supernatants of P. brasiliensis cultures as being an α-mannosidase. Because the expected mass of this α-mannosidase is 124.2-kDa, we suggest that the proteins were cleavage products. Indeed, we found an α-mannosidase activity in the culture supernatants among the excreted/secreted antigens (ESAg). Moreover, we determined that the enzyme activity was optimal in buffer at pH 5.6, at the temperature of 45ºC, and with a concentration of 3 mM of the substrate p-NP-α-D-Man. Remarkably, we showed that the gene expression of this α-mannosidase was higher in yeasts than hyphae in three P. brasiliensis isolates with different virulence degrees that were grown in Ham's F12 synthetic medium for 15 days. But in complex media YPD and Fava Netto, the significantly higher gene expression in yeasts than in hyphae was seen only for the virulent isolate Pb18, but not for intermediate virulence Pb339 and low virulence Pb265 isolates. These results about the high expression of the α-mannosidase gene in the pathogenic yeast form of P. brasiliensis open perspectives for studying this α-mannosidase concerning the virulence of P. brasiliensis isolates.