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A sífilis congênita (SC) é uma doença de transmissão vertical causada pelo Treponema pallidum provocando uma infecção do bebê ainda no útero. O diagnóstico da SC é difícil e tem sido feito por uma combinação de critérios clínicos e laboratoriais, o que torna necessário a busca por novos métodos de diagnóstico para auxiliar a tomada de decisão. Os testes moleculares, apesar de ainda não serem rotina nos laboratórios, estão sendo cada vez mais utilizados. A etapa pré-analítica de coleta da amostra, extração e preservação do DNA é fundamental. O uso de sangue fixado em cartão (SFC) tem sido uma alternativa no diagnóstico de várias doenças pela facilidade na execução da etapa pré-analítica. Nosso trabalho teve como objetivo detectar T. pallidum por reação em cadeia da polimerase (PCR) a partir de SFC de recém-nascidos que tiveram resultado positivo no PCR com a amostra de líquido cefalorraquidiano (LCR). Foram analisadas 82 amostras pareadas (sangue e LCR) de 41 RN na do Hospital da Criança Santo Antônio (HCSA), de Porto Alegre, RS, Brasil, sendo 22 positivas e 19 negativas. A sensibilidade e especificidade foram 63,3% e 100%, respectivamente. A concordância entre os métodos foi substancial (K=0,619), mostrando que a PCR diretamente de SFC pode ser promissora, desde que aperfeiçoada sendo uma possibilidade de diagnosticar a SC e facilitar a triagem neonatal.