Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui level air tebu terbaik untuk ditambahkan dalam pengencer semen ayam hutan merah berbasis ringer laktat kuning telur. Semen dikoleksi menggunakan metode pemijatan dan semen segar dievaluasi secara makroskopis dan mikroskopis. Semen dibagi ke dalam lima tabung yang masing-masing berisi pengencer ringer laktat kuning telur , ringer laktat kuning telur air tebu 10% , ringer laktat kuning telur air tebu 20% , ringer laktat kuning telur air tebu 30% , ringer laktat kuning telur air tebu 40% . Semen disimpan dalam refrigerator selama 24 jam kemudian dilakukan evaluasi motilitas spermatozoa (progresif, reverse, vibrator, total). Hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan level air tebu dalam pengencer berpengaruh sangat nyata (P<0.01) terhadap motilitas progresif, motilitas reverse dan motilitas total. Penambahan level air tebu 10% dan 20% menghasilkan motilitas total paling tinggi yaitu 86.24-88.79%. Namun, motilitas progresif tertinggi didapatkan pada penggunaan level air tebu 20% yaitu 77.67%. Kesimpulan penelitian ini adalah air tebu 20% dapat ditambahkan dalam pengencer ringer laktat kuning telur untuk mempertahankan motilitas total dan motilitas progresif spermatozoa ayam hutan merah selama penyimpanan 24 jam.