Inmunodetección por peroxidasa de células de ganglio sensorial infectadas por virus de rabia

Abstract

ResumenCon el objetivo de establecer una técnica de inmunocitoquimica por avidina-peroxidasa biotinilada para la detección de células infectadas in vitro por el virus rábico, se usaron cultivos de ganglio de la raíz dorsal de ratón. En este trabajo se presentan los resultados del proceso de estandarización de la inmunoperoxidasa, en la que también se usa el conjugado antirrábico producido en el lnstituto Nacional de Salud. Las diluciones de anticuerpo, que normalmente se usan en la inmunofluorescencia, muestran un excesivo ruido de fondo en la inmunoperoxidasa. Se discuten las posibles razones de este artefacto y se presenta un protocolo para la detección por inmunoperoxidasa de células de ganglio sensorial infectadas in vitro por virus de rabia. SummaryAn immunoperoxidase ABC technique was developed to detect rabies virus in dorsal root ganglion cells. This paper presents the standarization of the immunoperoxidase ABC technique which uses the antirabies conjugate produced by the Colombian lnstituto Nacional de Salud. Antibody dilution normally used in the fluorescence routine technique shows an excesive background in the ABC assay. We discuss the possible reasons and presenta protocol that minimizes the high background in the ABC immunoassay.El sistema de inmunodetección que utiliza un anticuerpo y una enzima biotinilados unidos por medio de una molécula de avidina, fue desarrollado en la década de los 80 por Hsu (1, 2) y, desde entonces, ha demostrado ser una metodologia fácil, reproducible y económica para la inmunocitoquímica. El sistema implica una fuerte amplificación de la señal del antigeno buscado por el uso de los anticuerpos primario y secundario y por la incubación con el complejo enzima-avidina (3-5), de tal manera que, cantidades de antigeno indetectables por otros medios, se hacen evidentes. por inmunofluorescencia directa, usando un anticuerpo primario acoplado a isotiocianato de fluoresceina (6-8). Con esta técnica se obtienen resultados reproducibles, aunque adolece de varios problemas, como el ser una preparación cuya vida útil e s muy corta, utilizar una concentración elevada de anticuerpo primario y requerir de un microscopio de fluorescencia, costoso y no siempre disponible.El Laboratorio de Neurobiologia del lnstituto Nacional de Salud está trabajando en un modelo M vitro para estudiar la interacción entre el virus rábico v las células del sistema nervioso. Con el La inmunodetección de las células infectadas in fin de obviar las limitantes señaladas en el vitro por el virus rábico se hace, generalmente, trabajo con fluorescencia, se presentó la

Ultrastructural description of rabies virus infection in cultured sensory neurons

“…Non-specific binding sites were blocked with 10% horse serum. Viral antigen was detected by using a hamster anti-rabies antibody at 1:900 dilution (diagnostic antibody produced by the Instituto Nacional de Salud, Colombia) incubated in Tris buffer, pH 8.6, for 1 h at 37ºC (Castellanos et al 1996). The respective biotinylated anti-hamster secondary antibody was then added (2.5 µg/ml).…”

“…The brain and cerebellum were extracted and each hemisphere was independently processed for later immunochemistry (IF and IP) or TEM. Tissue processed by immunochemistry was post-fixed in the same fixing solution overnight at 4ºC and then vibratome sectioned into 100 µm thick sections (Castellanos et al 1996). All the procedures described above had been previously approved by the Instituto Nacional de Salud's Ethics' Committee, in line with Colombian Ministry of Health Resolution 8430/1993.…”

Uso de una técnica de inmunoperoxidasa para la detección de virus de rabia en cortes gruesos de cerebro

“…En ambas técnicas, se logró hacer la detección de las zonas infectadas con un alto grado de especificidad, pero usando diluciones de anticuerpo diferentes, pues para la fluorescencia se usó la dilución de rutina (1:30) y la dilución que mejor se comportó en la técnica de peroxidasa fue de 1 :480. Resultados similares se reportaron en un trabajo anterior (6,7) y las dificultades fueron resueltas diluyendo también el anticuerpo primario. Los controles usados demuestran una buena sensibilidad y especificidad, de tal manera que la técnica de cortar en vibrátomo cerebros fijados podría ser útil en los casos en que los especímenes hayan sido fijados antes de las pruebas de confirmación de fluorescencia de improntas o inoculación en cerebros de ratón.…”