O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antimicrobiana do extrato, frações e punicalagina purificada da casca do fruto da romã, das variedades granada e wonderful, frente a Staphylococcus Coagulase Positivo (SCP) e Staphylococcus Coagulase Negativa (SCN), isoladas de vacas com mastite. As cascas dos frutos de romã foram secas em estufa, moídas e o extrato etanólico foi preparado por maceração e percolação. As frações foram obtidas por fracionamento líquido-líquido, e a purificação da punicalagina realizada em coluna cromatográfica preenchida com Diaion® HP-20. CLAE e RMN (1H e 13C -Acetona-d6) foram utilizados para identificação, quantificação e elucidação estrutural da punicalagina e a CIM (CLSI-M7A10) foi determinada para 23 isolados clínicos. O teor de punicalagina foi maior no extrato e frações da variedade granada, chegando a 81,5% na amostra de punicalagina purificada, que apresentou boa atividade antimicrobiana frente aos isolados clínicos, com ênfase para S. aureus e S. schleiferi schleiferi, onde a CIM foi de 31,75 μg/mL. Desta forma. a punicalagina foi definida como importante metabólito para o potencial antimicrobiano dos frutos de P. granatum contudo, o sinergismo dos metabolitos das frações acetato de etila e fração aquosa da variedade granada, teve considerável importância para a boa atividade antimicrobiana dessas frações, frente a 100% dos SCP e SCN. Assim, os resultados obtidos confirmam a atividade antimicrobiana dos metabólitos presentes na casca da romã, podendo fundamentar novas pesquisas de formulações farmacêuticas baseadas em P. granatum, como alternativa para o tratamento, prevenção e controle da mastite.