165Propriedades físicas e químicas do feijão, Ribeiro, Priudêncio-Junqueira e Miaguy. Londrina. Caixa Postal 6001, 3. Departamento de Bioquímica, Caixa Postal 6001,. * A quem a correspondência deve ser enviada. -INTRODUÇÃOEm países em desenvolvimento, os feijões são uma importante fonte de proteínas, calorias e outros nutrientes [18]. Entretanto, quando armazenados em condições de altas temperaturas e umidades relativas, comuns em países tropicais como o Brasil, eles se tornam endurecidos, ou seja, podem desenvolver o fenômeno conhecido como "hard-to-cook"(HTC) ou "difícil de cozinhar" [15].O fenômeno HTC em grãos de leguminosas afeta sua qualidade e aceitabilidade. Com o endurecimento, aumenta o tempo de cocção dos grãos e, conseqüente-mente, o gasto de energia, ocorrendo redução da palatabilidade e qualidade nutricional das leguminosas [18]. Feijões endurecidos não formam um caldo espesso e viscoso, sendo que este é um importante parâme-tro de qualidade para os consumidores de feijão na América Latina. Portanto, feijões endurecidos são menos aceitos pelos consumidores e causam importantes perdas [4], assim é de grande importância tanto a prevenção do endurecimento como a utilização de grãos endurecidos [13].Muitas hipóteses têm sido propostas para explicar a causa do endurecimento dos feijões, como: oxidação e/ou polimerização lipídica, formação de pectatos insolúveis, lignificação da lamela média, reação de β eliminação da pectina, desnaturação protéica, ligações cruzadas de proteínas desnaturadas e/ou de polifenólicos e mecanismos múltiplos [4,5,13,18]. LIU [13] apresentou um modelo de eventos múlti-plos, no qual considera-se que o defeito HTC desenvolve durante o envelhecimento e maceração e manifesta no cozimento. Neste modelo, a formação de radicais livres, peroxidação lipídica, formação de ácidos, deterioração da membrana, desnaturação protéica, vazamento e redistribuição de íons estão associados ao envelhecimento e maceração, enquanto que a degradação e solubilização da pectina, coagulação protéica e gelatinização do amido ocorrem durante o cozimento. PROPRIEDADES FÍSICAS E QUÍMICAS DE FEIJÃO COMUM PRETO

ABSTRACT

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ResumoBeauveria bassiana é um fungo entomopatogênico utilizado no controle biológico de insetos-praga que infestam produtos agrícolas. O mecanismo de infecção envolve a produção de enzimas extracelulares, como proteases e quitinases que degradam a cutícula dos insetos. O objetivo deste trabalho foi avaliar parâmetros cinéticos de pH, temperatura, concentração iônica e tempo de reação sobre a atividade de quitinases. O fungo B. bassiana CG432 foi repicado em broca do café Hypothenemus hampei (Ferrari) e utilizado para preparar o inóculo contendo 10 8 conídios ativados/mL. Estes conídios foram inoculados 1% (v/v) em meio de cultura líquido constituído por D-glicose (10g), extrato de levedura (5g), NaNO 3 (1,58g) , Na 2 HPO 4 .7H 2 O (1,05g), KCl (1g), MgSO 4 .7H 2 O (0,6g) e KH 2 PO 4 (0,36g) por litro. O cultivo foi conduzido a 28°C e 180rpm durante 5 dias. O fluido extracelular do cultivo foi obtido por filtração e centrifugação a 8.000g, e as quitinases foram isoladas e concentradas por ultrafiltração entre membranas de 10 e 100kDa sob pressão de nitrogênio. A atividade das quitinases foi determinada pela quantificação da N-acetilglicosamina liberada pela hidrólise da quitina coloidal durante 60 minutos de incubação a temperaturas de 40 a 60ºC, concentrações iônicas dos tampões acetato de sódio pH 4,0 a 6,0; fosfato de sódio pH 6,0 a 8,0; e glicina-NaOH pH 8,0 a 10,0, a 50, 100 e 200 mM. A atividade das quitinases foi máxima a 45ºC, em pH 5,5, mas também foi elevada em pH 6,0 e 8,5 em concentração iônica de 50mM. A atividade de quitinases aumentou durante uma hora de incubação demonstrando estabilidade das enzimas nas condições ótimas da reação. Palavras-chave: Fungos entomopatogênicos; Biocontrole; Hypothenemus hampei. AbstractEntomopathogenic fungus Beauveria bassiana is currently used as a biocontrol agent for agricultural pests. The infection process involves extracellular enzymes such as proteases and chitinases that degrade the cuticle of the insects. The objective of this work was to evaluate kinetic parameters of pH, temperature, ionic concentration and time of reaction on chitinases activity. The fungus B. bassiana CG432 was cultivated on coffee berry borer Hypothenemus hampei (Ferrari) and the conidia grown on insect were used to prepare the inoculum containing 10 8 conídia/mL. These conidia were inoculated at 1% (v/v) in

RESUMO. Lacases são glicoproteínas polifenol oxidases envolvidas na patogenicidade de alguns fungos e úteis em processos biotecnológicos. O ascomiceto ligninolítico Botryosphaeria rhodina tem sido estudado como produtor de exopolissacarídeos e de lacases PPO-I e PPO-II induzidas pelo álcool veratrílico. Como as lacases produzidas ainda não foram isoladas, o objetivo deste trabalho foi purificar lacases PPO-I e identificar os carboidratos constituintes da porção glicosídica. O fungo foi cultivado em meio mínimo de Vogel contendo 1% de glicose e 30,4 mM de álcool veratrílico, a 28°C e agitação de 180 rpm durante 4,5 dias. O extrato livre de células apresentou elevada concentração de carboidratos e de PPO-I estáveis a 4ºC e -18ºC durante 40 dias. Técnicas de ultrafiltração, cromatografia em gel Sephadex G-100 e em resina DEAE-Celulose purificaram lacases PPO-I com peso molecular de 113 kDa por eletroforese PAGE-SDS, contendo 40% de proteínas e 60% carboidratos identificados por HPAEC-PAD como fucose, galactose, manose, glucose e glucosamina.Palavras-chave: lacase, glicoproteína, exopolissacarídeo, purificação, Botryosphaeria rhodina.ABSTRACT. Purification of laccases PPO-I of fungus Botryosphaeria rhodina. Laccases are glycoprotein polyphenol oxidases which are involved in fungal pathogenicity and they are also useful for biotechnological applications. The ligninolytic ascomycete, Botryosphaeria rhodina, has been studied as producer of exopolysaccharide and PPO-I and PPO-II laccases induced by veratryl alcohol. However, as the induced laccases have not been isolated, the aim of this study was to purify the enzyme and to identify the carbohydrates constituents of the glycosidic moiety. The fungus was cultivated on broth Vogel, 1% glucose and 30.4mM veratryl alcohol during 4.5 days at 28°C/180 rpm. The extracellular fluid showed high carbohydrate concentration and the stability of PPO-I laccase under conditions of refrigeration and freezing at 4ºC-18ºC over 40 days. The purification was developed by ultrafiltration using a NMWL 100 and 30 kDa membrane, gelfiltration on Sephadex G-100, and ion-exchange chromatography on DEAE-cellulose. The purified laccase was identified as a glycoprotein, weight molecular 113 kDa, consisting of 40% protein and 60% carbohydrate identified by HPAEC-PAD as fucose, galactose, mannose, glucose and glucosamine.