Starch debranching enzyme was purified from intact spinach (Spinacia okracea L. cv Vital) chloroplasts and from a spinach leaf extract using affinity chromatography on Sepharose 6B-bound cycloheptaamylose (Schardinger,B-dextrin). The enzyme from both sources was homogeneous upon sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Spinach leaf debranching enzyme appears to consist of a single polypeptide chain, since the molecular weight of the native protein (110,000 daltons) was not changed by treatment with sodium dodecyl sulfate. Only one spinach leaf debranching enzyme band could be detected after electrophoresis of a leaf extract on amylopectin-containing polyacrylamide gel, the retardation factor of which coincided with that of the single band seen with the chloroplast enzyme. The purified enzyme exhibited strong pullulanase activity, the specific activity being 69 units per milligram protein with pullulan and 22 units per milligram protein with amylopectin. Cycloheptnamylose is a potent competitive inhibitor of spinach leaf debranching enzyme. The pH optimum of the enzyme was found to be 5.5. The purified enzyme is rather unstable at both 200 and 0°C. Part of the activity lost under storage or at a suboptimal pH could immediately be restored by the addition of thiols. The reactivatable protein, being of the same molecular weight as the native enzyme, exhibited a somewhat altered electrophoretic mobility resulting in one or two minor bands on a zymogram.In contrast to the enzymes of assimilatory starch formation, which are located exclusively in the chloroplast, the enzymes of starch degradation have been found in the cytosol as well as in the chloroplasts (1 1, 14). Their activities in the former compartment usually exceed those in the plastids by far (13). MATERIALS AND METHODSPreparation of Leaf Extract. Deribbed spinach leaves (Spinacia oleracea L. cv Vital; 820 g) were cut into small pieces and homogenized in 1,500 ml 50 mm sodium acetate buffer (pH 6.0) with a Multimix. The homogenate was then centrifuged at 16,300g for 30 min at 0°C. Solid (NH4)2 S04 was added to the supematant and the precipitate which formed between 40 and 50% saturation was used for further purification of the enzyme. The precipitated protein was dissolved in 20 to 30 ml of acetate buffer (as described above) and dialyzed for 12 h against bidistilled H20. Prior to affinity chromatography, the solution was freed from precipitated protein by another centrifugation step (45,000g for 30 min).Preparation of Chloroplast Extract. Intact chloroplasts were isolated from spinach leaves using the Mes and Hepes buffers 'A' and 'B' as described by Jensen and Bassham (7). The whole procedure was performed at 0°C. Deribbed spinach leaves (250 g) were homogenized in buffer A for 30 s with an Ultraturrax. The homogenate was filtered through eight layers of gauze and centrifuged for 2 min at 2,600g. The precipitate was suspended in 120 ml buffer B and cells and cell debris were removed by centrifugation at 30g (twice). From the sup...

Die Fettbindekapazitat (FBC) gilt als wichtige funktionelle Eigenschaft von Proteinen. Sie wird von vielen Autoren [4, 11,9, 121 als ein MaD der an der Oberflache wirksamen lipophilen Eigenschaften des Proteins angesehen, wobei Korrelationsbeziehungen zu den Proteineigenschaften Loslichkeit und Hydrophobie von NAKAI u. a. [7, 81 vorliegen. Andererseits ist verstandlich, daB eine dlbindung eines trockenen Proteinpulvers von der Beschaffenheit dieses Pulvers abhangig sein wird. So konnten WANG u. a. [12] einen Korrelationskoefizienten von -0,95 zwischen der FBC und der Schiittdichte eines Proteinpulvers nachweisen. Mehrere Autoren [l, 5, 6 , 101 bestatigten diesen engen Zusammenhang. Bei den bekannten Makromethoden zur Bestimmung der FBC wird das Protein mit iiberschiissigem 8 1 gut vermischt und die Menge des gebundenen 61s nach dem Zentrifugieren entweder aus dem Volumen des abgegossenen 01s ode!. aus der Gewichtszunahme des Proteins ermittelt. Dabei variieren die Verfahren hinsichtlich Protein-und Olmenge,' Ruhrintensitat und Zentrifugierbedingungen, ohne daD das Ergebnis dadurch wesentlich beeinfluDt wird. Eine obertragung des bewahrten Makro-Verfahrens von LIN u. a. [4] auf kleine Proteinmengen ist nach unseren Erfahrungen nur bei Berucksichtigung eines Blindwertes (das am GefaB anhaftende 01 betreffend) bis zu einer Proteineinwaage von 250 mg moglich. Das von VOUTSINAS u. a. [l I] beschriebene Mikroverfahren zur Bestimmung der FBC beruht auf einer Trubungsmessung der Fettemulsion nach einer sorgfaltigen Auswaschung des nur physikalisch anhaftenden 01s. Das Verfahren erfordert eine Auflosung des Proteins mit einem stark sauren AufschluRmedium. Unsere (Jntersuchungen ergaben, da13 dieser AufschluD bei einer Reihe, speziell pflanzlicher Proteine keine klaren Losungen lieferte, das Ergebnis folglich positiv falsch beeinfluht wurde. Das hier vorgestelhe neue und einfache Mikroverfahren zur Bestimmung der FBC erfordert einen Proteineinsatz von ca. 50 mg. Die Hauptmenge des freien anhaftenden 81s wird aus dem Protein-61-Gemisch ab-gepreBt und aus dem gepreDten Riickstand das gebundene 81 mit Chloroform extrahiert. Beschreibung der MethodeCa. 50 mg Protein werden im Zentrifugenglas rnit 3 ml Speiseol 1 min bei 1000 U/min (LKR 2 von Labortechnik I1menau;DDR) geruhrt und anschlieDend I 5 min bei 4000 g zentrifugiert. Das 6 1 wird abgegossen und das Rohrchen auf Zellstoff 10 min umgestiirzt stehengelassen. Danach wird der Bodensatz herausgeschabt udd das anhaftende 81 zwischen 2 Stiicken Chromatographiepapier FN4 (VEB Spezialpapierfabrik Niederschlag, DDR) und zwei Glasplatten mit 500 g belastet 10 min abgepreDt. Eine genau eingewogene Probe dieses gepreDten Materials (20-40 mg) wird in einer 10 GCFritte bekannten Gewichts mit insgesamt 5 ml Chloroform erst etwas iiberschichtet und dann tropfenweise durchspiilt ; danach wird kurz abgesaugt. Nach 30min. Stehen wird die fettfreie Proteinmenge gewogen und so die gebundene 8lmenge ermittelt. (m, -m,) ' 100 ea, . (mgm,) FBC = -'lo FBC = m1/100 g Protein mo = Masse der Fritt...

Zur Bildung fliichtiger Stoffe bei der MAILLAm-Reaktionl I. LUDWIG, I<. BOTTGER und U. FREIMUTH Untersuchungen der bei der MAILLARD-Reaktion von Casein und Lactose entstehenden fltichtigen Stoffe ergaben. daO Einzelheiten der Vorbehandlung des Reaktionsgemisches (Mischen, Lyophilisation) einen wesentlichen EinfluD auf die Reaktion ausiiben. Aus denrelativenverhatnissen der gaschromatographisch ennittelten Peaks lieB sich ftir alle Priiparate auDerdem eine deutliche Abhtingigkeit von der Erhitzung erkennen. Erganzende Bestimmungen des Farbindex durch Reflexionsmessungen sowie sensorische Befunde stimmten hiennit iiberein. Wegen ihrer grooen Bedeutung fiir die Qualittit von Lebensmitteln ist die MluLLaRD-Reaktion seit ihrer Entdeckung 1912 iiberaus Uufig studiert und zusammenfassend beschrieben worden [I -51. Sowohl die Bildung der dunkelbraunen Reaktionsprodukte [6-91 wie etwa die Entstehung von Allergenen [IO, 111 wurden eingehend untersucht. Der EinfIuD des Wassergehaltes auf den Reaktionsablauf hat seit den grundlegenden Modellversuchen von LEA u. a. [6] gebiihrende Berlicksichtigung gefunden. So liegen auch tiber die in Milchpulver erfolgende Reaktion zahlreiche Arbeiten vor, da beim Trocknen oder bei der Lagerung des Milchpulvers durch die Gegenwart der reduzierenden Lactose in hoher Konzentration die Briiunungsreaktion begtinstigt wird [6, 7, 12. 131. DaD dabei auch mehrere fliichtige Substanzen enbtehen, die ftir das Aroma des Endproduktes wichtig sind, wurde schon vor etwa 20 Jahren festgestellt [14-161 und in Modellversuchen von verschiedenen Autoren studiert [17-22].

Die für Proteine ausgearbeiteten Bestimmungsmethoden für die Emulgierfähigkeit, die Oberflächenhydrophobie und die Grenzflächenspannung sind auch auf komplexe Peptidgemische anwendbar. Während das Emulgierverhalten von Proteinen wesentlich von ihrer strukturbedingten Oberflächenhydrophobie bestimmt wird, sind für Plasteine aus Ackerbohnenproteinisolat offenbar andere strukturgebundene Faktoren dafür maßgeblich. Für enzymatische Partialhydrolysate aus Ackerbohnenproteinisolat lassen sich je nach eingesetzter Enzymart aus der mittels Anlagerung von Anilinonaphthalinsulfonsäure bestimmten Oberflächenhydrophobie ebenfalls Aussagen zum Emulgierverhalten gewinnen.

U. FREIMUTH und I. LUDWIG Die Arninosaurezusdmmensetzung der Milchproteine j3-Casein und /%Lactoglobulin wurde gaschromatographisch quantitativ bei einfachen apparativen Bedingungen bestimmt. Mit dem gleichen Verfahren wurde die durch MAILLARD-Reaktion in beiden Proteinen hervorgerufene Veranderung des Aminosauregehaltes ermittelt. Dabei zeigte sich. dal3 die ausgearbeitete Methode rnit befriedigender Prazision und Reproduzierbarkeit durchfuhrbar ist. Die fruher beobachtete Lysinschadigung in diesen Proteinen von 30-35 " ; bei der MAILL.ARD-Reaktion rnit Lactose tritt beim /?-Lactoglobulin bereits auf, wenn das molekulare Verhaltnis von NHz-zu CO-Gruppen 2 : I betragt. Material und Methoden 41s Proteine dienten reines /]-Casein und kistrallines /I-Lactoglobulin, die nach den iiblichen Verfahren \ I , 2 ) hergestellt wurden. Zur Gewinnung der trocknen ProteiniLactoselMischungcn wurden die Proteine in wrnig Wasser gelost bzw. suspendiert, mit einer Losung von Lactose in Wasser gemischt und danach pefrier-$:thrung. Bd 26. H I