Infeksi adalah penyakit yang dapat menimbulkan gejala klinis atau asimtomatis yang dipicu oleh mikroorganisme seperti bakteri. Pseudomonas aeruginosa dan Bacillus subtilis merupakan bakteri yang dapat menimbulkan infeksi nosokomial. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas antibakteri dari ekstrak dan fraksi rimpang lengkuas putih (Alpinia galanga) terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa dan Bacillus subtilis dan mengidentifikasi golongan senyawa yang berperan sebagai agen antibakteri. Ekstrak diperoleh dari maserasi lengkuas menggunakan metanol 70%. Metode difusi disk dipilih dalam uji aktivitas antibakteri. Sampel yang diuji adalah ekstrak dengan konsentrasi 10,5; 12; 13,5; dan 15 mg/disk, fraksi metanol 15 mg/disk, fraksi etil asetat 15 mg/disk, fraksi kloroform 15 mg/disk, kloramfenikol sebagai kontrol positif, dan DMSO sebagai kontrol negatif. Hasil uji ekstrak metanol menunjukkan adanya aktivitas antibakteri terhadap Pseudomonas aeruginosa dan Bacillus subtilis pada konsentrasi 15 mg/disk dengan diameter zona hambat berturut-turut adalah 13,5 ± 0,41 mm dan 16,0 ± 0,41 mm. Hasil uji fraksi etil asetat menunjukkan adanya aktivitas antibakteri terbesar terhadap Pseudomonas aeruginosa dan Bacillus subtilis dengan diameter zona hambat berturut-turut adalah 12,0 ± 0,41 mm dan 13.7 ± 0,24 mm. Identifikasi golongan senyawa rimapang lengkuas putih (Alpinia galanga) menggunakan metode KLT dengan silika gel GF254 sebagai fase diam, kloroform : etil asetat (1:1 v/v) sebagai fase gerak untuk mengelusi plat ekstrak, dan kloroform : metanol (9:3 v/v) sebagai fase gerak untuk mengelusi plat fraksi etil asetat. Hasil uji fitokimia rimpang lengkuas putih (Alpinia galanga) menunjukkan ekstrak metanol positif mengandung alkaloid, fenolik, flavonoid, dan terpenoid, sedangkan pada fraksi etil positif mengandung fenolik, flavonoid, dan terpenoid. Uji bioautografi menunjukkan golongan senyawa yang mampu menghambat bakteri Pseudomonas aeruginosa dan bakteri Bacillus subtilis adalah fenolik, flavonoid, dan terpenoid.